马慧敏，于 猛，黄后宝，李亚伟，张 鹏，黄建军，程 龙，冯 钢

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.检验科；2.泌尿外科,安徽 芜湖 241001)

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是肾癌中最常见的病理学类型，其发病率和病死率在世界范围内不断上升。手术切除是目前治疗肾透明细胞癌的主要方式，但约30%的患者在术后可出现肿瘤的转移[1-2]。近年来，分子靶向药物开始逐步应用于肾癌的临床治疗，极大的提高了患者的生存，但晚期ccRCC患者的预后依然较差。因此，寻找有效的肾癌分子标志物对于肾癌的早期诊断、预后判断等具有重要的临床意义。

脊椎蛋白2(SPON2)是一种细胞外基质分泌蛋白，在获得性免疫和先天性免疫中发挥着重要作用，可募集炎性细胞和促进神经元生长。近年来多项研究表明，在肝癌、结直肠癌、胃癌和肺腺癌中，SPON2的表达与患者预后存在显著相关[3-6]。但是SPON2在ccRCC中的表达及其功能，目前尚未见报道。本研究通过检测ccRCC中SPON2基因的表达情况，分析其与ccRCC患者临床病理指标的相关性，并采用体外实验研究SPON2在ccRCC中的生物学功能，旨在阐明SPON2在ccRCC中的临床意义及其功能。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 本研究收集2018年1月～2019年7月弋矶山医院114例ccRCC患者肿瘤组织及其癌旁组织标本，其中男性66例，女性48例，年龄28～83岁。所有患者术前均未接受过辅助治疗。原位ccRCC定义为初次评估时无远处转移或腹膜后淋巴结转移。肿瘤分期按2010年AJCC的TNM分期标准，病理分级按Fuhrman分级标准。本研究已获得参与者的知情同意。

1.1.2 细胞株 人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)和人肾透明细胞癌细胞株(786-0细胞，Caki-1细胞)均购自于北京北纳科技有限公司。

1.1.3 主要试剂和仪器 DMEM培养基、PPMI-1640培养基、McCoys 5A培养基、胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白上样缓冲液、Marker、ECL显色试剂盒(Beyotine)，Lipofectamine 2000(invitrogen)，SPON2抗体、β-actin抗体(Abcam)，Trizol Universal、mRNA逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，xCELLigence 实时细胞分析仪、E-Plate板(ACEA)，凋亡检测试剂(北京贝博生物公司)，逆转录仪、荧光定量PCR仪、垂直电泳仪(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 取各例肿瘤组织石蜡标本切片(4 μm)，按脱蜡水化、抗原修复、去内源性酶、抗原封闭、SPON2一抗、二抗孵育、发色、苏木精复染、脱水、封片、镜检、结果判定进行免疫组化染色，显微镜下随机选取5个视野观察，染色为棕黄色或棕褐色的为SPON2阳性。

1.2.2 细胞总蛋白的提取和Western Blot 细胞裂解、蛋白浓度定量后，SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜，SPON2一抗封膜并孵育过夜，二抗洗膜，加入显影液，采用凝胶成像系统分析条带显影情况。

1.2.3 细胞转染和RT-PCR 采用Lipofectamine 2000试剂盒进行细胞siRNA转染。TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录cDNA后，qPCR扩增检测。以β-actin为内参，计算SPON2的相对表达量。

1.2.4 增殖实验和凋亡实验 向E-Plate板中加入50 μL McCoy′s5A培养基，RTCA分析仪(置于37℃ 5% CO2培养箱中)设置基线，于E-Plate 板中加入100 μL(6×103)细胞悬液，室温放置30 min，置于RTCA分析仪中，实时监测3 d。

细胞转染24 h后，胰酶消化，计数,接种于6孔培养板上,每孔接种500细胞,于37℃、5%CO2培养箱中培养10 d，4%多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色15 min，镜下拍照计数。

细胞转染48 h后，胰酶消化细胞，PBS洗2遍，50 μL 1×binding buffer重悬细胞，上述细胞悬液中分别加入Annexin-FITC和PI 染液各5 μL，混匀，避光孵育15 min，加1×PBS 250 μL，1 h内上机检测。

1.2.5 划痕实验和transwell侵袭实验 细胞转染24 h后，用灭菌的100 μL枪头在培养板中垂直均匀划线，PBS清洗脱落的细胞3次，每孔加入2 mL无血清培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱继续培养，分别于0、24 h对细胞进行观察并拍照。

细胞转染24 h后，胰酶消化，用无血清的McCoy′s5A培养基配成单细胞悬液，每孔加入Matrigel 50 μL铺胶于Transwell膜小室，置于37℃ 30min。取制备的细胞悬液200 μL(5×103)加入Transwell小室上室，下室加入含10%FBS的McCoy′s5A培养基500μL，置于37℃培养箱常规培养24 h，PBS适当清洗，4%多聚甲醛固定30 min，风干，0.1%结晶紫染色15 min，PBS清洗，选取5个视野直接镜下拍照观察穿膜细胞数，取平均值。

2 结果

2.1 SPON2在ccRCC中表达增高 ccRCC癌组织中SPON2蛋白阳性表达率(60.53%)高于癌旁组织(36.84%)，差异有统计学意义(χ2=12.798，P=0.000)；ccRCC癌组织中mRNA表达水平高于癌旁组织(t=23.293，P=0.000)(见表1)。免疫组化显示，SPON2主要分布于胞质中，染色为棕黄色或棕褐色的为SPON2阳性表达(图1A)。SPON2 mRNA在Caki-1细胞中的表达高于HK-2细胞(P<0.05)，但HK-2细胞和786-0细胞中SPON2 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。Western Blot实验也验证了上述结果(图1B)，因此采用Caki-1细胞进行后续的功能研究。siRNA瞬时转染Caki-1细胞24 h后，SPON2的表达降低，表明转染成功，其中siRNA1-SPON2的敲除效果最显著(图1C)。

A.免疫组化；B.SPON2在3株细胞中的蛋白表达；C.Caki-1细胞株中SPON2干扰后的蛋白表达。

表1 SPON2在ccRCC组织及癌旁组织的表达

表2 SPON2在ccRCC细胞株中的表达

2.2 SPON2与ccRCC患者临床病理资料的关系 如表3所示，SPON2 mRNA表达水平和SPON2蛋白表达水平均和ccRCC患者的年龄、性别、组织坏死相关性无统计学意义(P>0.05)，但与ccRCC患者的肿瘤直径、TNM分期、Fuhrman分级、肉瘤样改变、淋巴结转移、远端转移均存在相关性(P<0.05)。

表3 SPON2与ccRCC患者临床病理资料的关系

2.3 SPON2敲减可抑制ccRCC细胞的迁移和侵袭 RTCA增殖实验显示，siRNA-SPON2组和对照组的生长曲线基本一致(图2A)。克隆形成实验显示，siRNA-SPON2组细胞克隆数(0.92±0.17)和对照组(1.00±0.00)差异无统计学意义(t=-0.833，P=0.493，见图2B)。siRNA-SPON2组细胞总凋亡率(0.77±0.21)%与对照组(0.90±0.30)%差异无统计学意义(t=-0.632，P=0.561)，见图2C。划痕实验显示，siRNA-SPON2组的细胞伤口愈合率(31.00±3.60)%低于对照组(92.33±4.04)%(t=19.614，P=0.000，见图2D)。侵袭实验结果显示siRNA-SPON2组的细胞侵袭数(0.48±0.08)与对照组相比(1.00±0.00)减少(t=11.717，P=0.007，见图2E)。

A.RTCA增殖实验;B.克隆形成实验;C.凋亡分析;D.划痕实验;E.侵袭实验。

3 讨论

作为一种细胞外基质蛋白，SPON2具有募集炎症细胞、激活固有免疫应答等多种功能。近年来，在多种肿瘤中发现SPON2存在高表达，包括肝癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌[7-9]。本研究采用免疫组化和RT-PCR检测了114例ccRCC患者样本中SPON2的表达，发现SPON2蛋白和mRNA在ccRCC中的表达水平均高于癌旁组织，并且还发现SPON2的表达和肿瘤直径、肿瘤的临床分期和病理分级明显相关，提示SPON2的高表达可能与肾透明细胞癌的发生有关。肉瘤样改变被认为是高侵袭性ccRCC的一个特征。我们发现SPON2在伴肉瘤样改变的ccRCC中表达水平高于无肉瘤样改变的ccRCC。此外，在ccRCC转移患者肿瘤组织中，SPON2的表达升高，提示SPON2与ccRCC的转移潜能有关。

本研究发现Caki-1细胞中SPON2 mRNA和蛋白水平均高于786-0、HK-2细胞。但在786-0和HK-2细胞之间未发现上述差异。此外，敲除SPON2未能显著改变Caki-1细胞的体外增殖、集落形成和细胞凋亡，此结果不同于既往的报道[4,9]。我们推测SPON2在不同类型肿瘤中的功能存在差异。在本研究中，SPON2高表达与ccRCC转移密切相关，敲除SPON2可明显降低Caki-1细胞的侵袭和迁移能力。然而，Zhang等[7]的研究显示，过表达SPON2可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。因此SPON2在肿瘤细胞侵袭和迁移中的作用是复杂的，需要进一步的研究。

作为一项回顾性观察研究，纳入的患者数量相对较少，我们的结果可能不具有充分的代表性。SPON2在ccRCC中确切的作用机制还需要进一步的研究。综上所述，SPON2在ccRCC中表达增高，且与肿瘤直径、肿瘤分期、Fuhrman分级、肉瘤样改变和转移相关。敲除SPON2能够抑制ccRCC细胞的侵袭和迁移能力。