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水蛭滑石粉烫制工艺的优化及其质量分析

2020-10-14刘晓鑫

中成药 2020年9期
关键词:滑石粉浸出物水蛭

刘 敬,赵 斌*,刘晓鑫,曹 晖,王 琼

(1.中山火炬职业技术学院健康产业学院,广东 中山 528436;2.国家中药现代化工程技术研究中心中山健康产品分中心,广东 中山 528436;3.广东药科大学中药学院,广东 广州 510006;4.国家中药现代化工程技术研究中心,广东 珠海 519085)

水蛭是一味具有破血通经、逐瘀消癓的常用动物类中药,现收载于2015 年版《中国药典》一部[1],该药材使用历史悠久,始载于《神农本草经》,但因其药效峻猛、有小毒而被列为下品,临床上常将其炮制后再内服使用[2]。汉代《金匮玉函经》载有“熬”,为水蛭最早的炮制方法,宋代至清末的文献中还有不加辅料炮制(炒、煨、焙)、加辅料炮制(米制、石灰制、猪脂制、麝香制、盐制、油制)等10 余种方法,实质上均为加热处理[2-3]。

目前,市场上常见的水蛭炮制品有(净)水蛭、烫水蛭、酒炙水蛭等,其中烫水蛭主要以滑石粉为辅料,收载于自1977 年版起的历版《中国药典》、1988 年版《全国中药炮制规范》,以及广西、浙江等地方炮制规范中[4-6]。现代学者研究酒炙[7]、滑石粉加酒和姜炮制[8]、麦麸加酒炮制[9]、焙制、电热烘烤[10]等水蛭炮制新方法,也关注了炮制前后其水溶性蛋白的差异性[11]、不同炮制方法下的体外抗凝活性[12]。但国家和地方炮制规范对水蛭烫制工艺的温度、时间、滑石粉用量、翻炒速度等关键参数均无统一规定,大多凭药工主观经验来进行评价[4-6],从而影响了炮制品质量。课题组前期制定了一些药材的滑石粉烫制工艺规范[13-15],本实验在此基础上采用星点设计-效应面法优化水蛭滑石粉烫制工艺,并分析了炮制前后其理化指标的变化,以期为相关标准的制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器 CY-20 型电热型炒药机(江阴市祝塘明科机械厂);2500C 型粉碎机(永康市艾泽拉电器有限公司);101-2AB 型鼓风烘箱(天津泰斯特仪器有限公司);ATX224 电子分析天平(日本岛津公司);A300 全自动氨基酸分析仪(德国曼默博尔公司);K9860 全自动凯氏定氮仪(济南海能仪器股份有限公司);DCY-12G 氮吹仪(青岛海科仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 水蛭购于广州汉草医药科技有限公司(批号20170409),经中山火炬职业技术学院赵斌教授鉴定为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman。滑石粉(陕西圣瑞医药科技有限公司,批号20170518);牛纤维蛋白原(100 mg,批号F20170412)、凝血酶(1 000 U,CAS 号9002-04-4)(合肥博美生物科技有限责任公司);氨基酸标准品溶液(德国曼默博尔公司,含18 种氨基酸,胱氨酸浓度为50 nmol/mL,其余均为100 nmol/mL)。乙醇、氯化钠、三羟甲基氨基甲、盐酸等试剂均为分析纯;水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 烫制工艺优化

2.1.1 因素水平确定 翻炒速度为非连续性数据,故本实验将其设定为12 r/min。以烫制温度(A)、烫制时间(B)、滑石粉用量(C)为影响因素,各因素5 个水平,见表1。

2.1.2 烫制品制备 取20 份净水蛭段,每份50 g。先将滑石粉加入炒药机内,待机器达到规定温度后再投入药材,翻炒规定时间(12 r/min)后立即取出,筛去滑石粉,放凉,即得。

表1 因素水平

2.1.3 评价指标测定

2.1.3.1 粉碎率 取烫制品20 g,粉碎30 s 后过100 目筛,收集,称定过100 目筛粉末的质量,计算粉碎率。

2.1.3.2 醇溶性浸出物 按2015 年版《中国药典》四部2201 的醇溶性浸出物测定法中的热浸法进行测定,浸出溶剂为稀乙醇。

2.1.3.3 抗凝血酶活性 按2015 年版《中国药典》一部水蛭项下方法[1,16]进行测定。

2.1.4 数据处理 “2.1.3”项下指标测定结果越大,炮制效果越好,故本实验按公式dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)进行转换,求得“归一值”[17],再计算几何平均数,得总评“归一值”(OD),公式为OD=(d1d2…dn)1/n(n=3)。结果见表2。

表2 试验设计与结果

2.1.5 模型拟合及方差分析 通过Design-Expert 8.0.5b版软件对表2 数据进行多元线性回归和二项式拟合,得方程为OD=-0.57+0.036A+0.027B-0.031C-0.15AB-0.091AC-0.094BC-0.090A2-0.11B2-0.011C2(R2=0.955 7,P<0.000 1)。方差分析显示,各因素影响程度依次为烫制温度(A)>滑石粉用量(C)>烫制时间(B),其中炮制温度具有显著影响(P<0.05);所得方程拟合度良好,可信度高(R2=0.955 7,P<0.000 1)。

2.1.6 响应面分析 见图1。综合考虑实际炮制过程中的可操作性,确定最优工艺为烫制温度195 ℃,烫制时间3.5 min,滑石粉用量30%,OD为0.641。

2.1.7 验证试验 根据优化工艺进行3 批验证试验,测得平均OD为 0.633,与预测值 0.641 接近(偏差为-1.25%),表明工艺稳定可行。生品和烫制品见图2。

2.2 质量评价

2.2.1 水分、醇溶性浸出物、含氮量、抗凝血酶活性测定 按照2015 年版《中国药典》方法进行测定[1],结果见表3。由此可知,烫制后上述指标均较生品下降。

表3 水分、醇浸出物、含氮量、抗凝血酶活性测定结果(n=2)

2.2.2 氨基酸含有量测定 参考文献[18]报道。精密称取水蛭粉末约30 mg,置于水解管中,加入6 mol/L 盐酸15 mL、苯酚3~4 滴,于冷冻机中冷却3 min 后抽真空,充氮气,重复3 次,在充氮气状态下封口,再于烘箱中加热至110 ℃水解22 h,取出,冷却至室温,过滤水解液,滤液转移至50 mL 量瓶中,水解管用水洗涤3~5 次,洗液合并至量瓶中,加水定容至刻度,精密吸取1.0 mL 至试管中,40 ℃下减压干燥,残渣加2 mL 水溶解后干燥,最后蒸干,精密加入pH 2.2 的柠檬酸钠缓冲液1 mL,振摇溶解,滤过,取续滤液,作为供试品溶液。

图1 各因素响应面图

图2 水蛭烫制前后形态

将对照品、供试品溶液注入氨基酸分析仪中,外标法计算含有量,结果见表4。由此可知,烫制品中氨基酸平均总量为51.71%,含全部16 种氨基酸,以谷氨酸含有量最高,达8.61 mg/100 mg,占氨基酸总量的16.7%;含有苏氨酸等7 种人体必需氨基酸,总量为18.4 mg/100 mg,占氨基酸总量的35.6%。

表4 各氨基酸含有量测定结果(n=2)

3 讨论

本实验采用星点设计-效应面法,选择烫制温度、烫制时间、滑石粉用量3 个关键参数,对水蛭滑石粉烫制工艺进行优化,可为其炮制规范的制定提供合理依据。总评“归一值”是多指标数据处理的一种较科学的方法,能客观量化地体现所有指标,从而使模型具有更好的预测性[17],本实验将烫制工艺中的粉碎率、醇溶性浸出物、抗凝血酶活性等指标综合起来,以该方法来表达最终效应,所得结果更科学合理。

生水蛭质韧难碎,气味腥臭,严重影响其直接使用,故自古就对其进行加热处理,其中滑石粉烫是最主流的炮制方法,其目的主要有去腥矫味、使药材质地酥脆、利于粉碎、降低毒性等[2]。本实验结果显示,滑石粉烫制后水蛭含水量下降,质地松泡,腥臭味明显下降,有利于临床应用。

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