UPLC 法同时测定小儿咳喘灵颗粒中5 种成分

2020-10-14钱叶飞陆林玲张华锋

中成药 2020年9期

钱叶飞陆林玲张华锋周坚

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州215104）

小儿咳喘灵颗粒是由金银花、麻黄、板蓝根、甘草、苦杏仁、石膏、瓜蒌7 味药材组成的中药复方制剂，具有止咳祛痰、宣肺清热的功效，临床上广泛用于治疗上呼吸道感染及其引起的咳嗽等病症，是儿科常用中成药之一［1-4］，但其现行质量标准中仅检测绿原酸或盐酸麻黄碱单一成分的含有量［5-6］，过于简单，而且方法也不统一。目前，大多数文献［7-11］采用HPLC 法分析小儿咳喘灵颗粒中主要成分，为了节约时间与成本，加快检验进度，本实验建立UPLC 法同时测定其中板蓝根活性成分（R，S）-告依春、金银花活性成分绿原酸、苦杏仁活性成分苦杏仁苷、甘草活性成分甘草苷和甘草酸的含有量，以期为该制剂质量标准提高提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity H-Class UPLC 超高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（PDA）、Empower 3化学工作站（美国Waters 公司）；电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Millipore Synergy超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试剂与药物（R，S）-告依春、甘草苷、苦杏仁苷、绿原酸（批号分别为111753-201706、111610-201607、110820-201607、110753-201716，纯度分别为93.1%、90.7%、99.3%）对照品均购于中国食品药品检定研究院；甘草酸（批号MUST-17060805，纯度99.65%）对照品购于成都曼思特生物科技有限公司。36 批小儿咳喘灵颗粒来自全国11个厂家。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；检测波长207 nm（苦杏仁苷）、237 nm［（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸］；进样量1 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液分别精密称取（R，S）-告依春、甘草酸、甘草苷、苦杏仁苷、绿原酸对照品10.83、9.27、10.88、11.80、10.07 mg，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，作为贮备液（质量浓度分别为1.083 0、0.923 8、1.012 9、1.070 3、1.000 0 mg/mL）。各精密吸取2 mL，置于20 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（质量浓度分别为108.300 0、99.995 1、92.375 6、101.292 8、107.026 0 μg/mL）。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 供试品溶液取颗粒适量，研磨成细粉后精密称取2.0 g，置于20 mL 量瓶中，加入15 mL 50%甲醇超声（250 W、33 kHz）处理30 min，放冷至室温，50%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按照颗粒处方比例和制备工艺，分别制备缺板蓝根、缺苦杏仁、缺甘草、缺金银花的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各1 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度理想，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验精密吸取同一份供试品溶液（批号170908），在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面积RSD 分别为0.63%、0.55%、0.07%、0.79%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液（批号170908），于0、6、12、18、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面积RSD分别为2.37%、1.78%、0.64%、1.86%、2.29%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.l UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 重复性试验精密称取同一批颗粒（批号170908）6 份，按“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面积RSD 分别为0.47%、0.98%、0.14%、0.95%、0.24%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验取各成分含有量已知的同一批颗粒（批号170908）6 份，每份约1 g，精密称定，精密加入适量对照品溶液，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

2.9 耐用性试验本实验考察了Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Waters Acquity HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，发现各成分均能达到比较理想的分离效果，表明该方法耐用性良好。

2.10 样品含有量测定取11 个厂家生产的36 批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。

3 讨论

3.1 检测指标筛选麻黄为小儿咳喘灵颗粒君药，对制剂宣肺止咳的功效发挥着关键作用，但其主要成分麻黄碱和伪麻黄碱具有挥发性，提取方法与其他成分不同，而且普通的C18色谱柱对两者分离效果不佳［12-13］，故今后课题组将对相关质量评价方法进行改进。另外，方中石膏、瓜蒌主要成分尚不明确，也未纳入研究。因此，本实验选择板蓝根、苦杏仁、甘草、金银花所含主要成分作为检测指标。

3.2 检测波长筛选本实验采用二极管阵列检测器在200～400 nm 波长处进行扫描，并结合2015年版《中国药典》，以物质吸收大小和与其他色谱峰分离度为指标，最终确定为207、237 nm 双波长检测。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3.3 供试品溶液提取方法筛选根据文献［14］报道，本实验考察了提取溶剂30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇，溶剂用量10、20、30、50 mL，提取时间15、30、45 min 对各成分提取效果的影响。最终确定，最优供试品溶液提取方法为20 mL 50%甲醇提取30 min。

3.4 含有量分析 36 批小儿咳喘灵颗粒中（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷最高含有量分别是最低含有量的9.67、60.72、23.22、22.49、88.89 倍。由此可知，不同厂家和同一厂家不同批次生产的样品中各成分含有量差异均较大，质量参差不齐，可能与药材产地、采收季节、生产工艺等因素有关，具体原因有待进一步研究。