曾维星, 程 贤, 张笮晦, 毕良武*, 赵振东

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;生物质化学利用国家工程实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;江苏省生物质能源与材料重点实验室;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210042; 2.广西中医药大学 药学院;广西中药药效研究重点实验室,广西 南宁 530200; 3.广西庚源香料有限责任公司, 广西 东兴 538100)

Waksman和Cordon在1939年第一次利用微生物处理苜蓿(MedicagosativaLinn.)，揭开了生物预处理研究的序幕[1]。早先对生物预处理的研究主要包括微生物的筛选、生物预处理的工艺优化[2]、生物预处理的作用机制研究[3]以及生物预处理的应用。随着生物预处理研究的发展，不断涌现出微生物发酵技术在天然产物提取中的应用[4]。以微生物发酵技术为预处理手段应用于天然产物的提取主要利用了微生物发酵过程中产生纤维素酶等多种细胞壁水解酶，从而提高了天然产物提取率[5-7]。其中，生物酶是微生物发酵技术应用于天然产物提取的关键。伴随着生物酶商业化生产的实现，生物酶辅助技术也被广泛用于天然产物提取领域[8-11]。作者综述了微生物发酵技术和生物酶处理技术2种生物预处理技术在天然产物提取中的作用机制和实际应用，旨在显著提升天然产物开发利用的技术水平，为实现肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、油樟(Cinnamomumlongipaniculatum(Gamble) N. Chao ex H.W. Li)等具有中国特色的大宗天然资源的高效提取与利用研究提供参考。

1 生物预处理技术

1.1 微生物发酵技术

1.1.1发酵类型

1.1.1.1液态发酵 液态发酵首先是将原料粉碎后制备成液体培养基，然后将微生物菌株接种在培养基中，发酵液供分离提取。液态发酵技术具有菌体生长快速、生产周期短、宜于工业化生产、无季节性等特点。目前液态发酵技术多运用于抗生素、黄酮等天然产物提取的预处理阶段。辛燕花课题组[12-13]以灵芝作为菌株，采用液态发酵技术处理银杏叶，研究结果表明灵芝多糖和黄酮分别提高了1.98 倍和2.35倍；以灵芝作为菌株，在30 mL基础发酵液、何首乌添加量为0.15 g、添加时间为发酵第3天、初始pH值8.0、发酵时间9 d，在此条件下灵芝总黄酮产量为20.74 mg/g，相比对照灵芝菌丝体(未添加何首乌)提高了3.23倍。

1.1.1.2固态发酵 固态发酵技术是将待提取原料直接作发酵基质或粉碎后作为发酵基质，利用1种或多种真菌为发酵菌种进行发酵。固态发酵与液态发酵的区别主要在于固态发酵体系含水量低且为自然发酵。因此固态发酵周期较长，过程复杂，缺乏质量控制指标，难以实现工业化生产，其优点在于成本低廉。王吉成等[14]以冠突散囊菌为发酵菌种，对桑叶进行固态发酵，最后使用体积分数70%乙醇进行提取，研究表明：发酵后桑叶提取物的总黄酮含量高于未发酵的桑叶总黄酮含量，对Fe2+的螯合能力显著升高。李季文等[15]对黄芪-女贞子进行真菌固态发酵，成功富集了黄芪多糖。

1.1.2发酵原理 微生物发酵技术作为天然产物提取的生物预处理方式之一，其原理是借助微生物在适当条件下对提取原料进行发酵处理，微生物生长代谢过程会产生丰富的生物酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等，进而破坏植物原料的细胞壁。Brunecky等[16]研究表明厌氧真菌可以分泌高活性的纤维素酶、半纤维素酶、纤维小体等，可以协同分解利用结构复杂的纤维素、半纤维素和果胶等物质。这些高活力的生物酶是导致植物细胞壁降解、细胞间隙增加的有力工具。Wang等[17]研究表明厌氧真菌可以通过假根系统破坏细胞壁结构使其变疏松，从而易于被其他微生物和水解酶降解。因此，发酵技术作为天然产物提取的预处理手段有助于促进植物有效成分的释放及其在提取介质中的扩散，从而增加了天然产物的提取效率，其作用机制如图1所示。

图1 发酵技术的作用机制Fig.1 Mechanism of fermentation technology

1.1.3影响因素 在实际应用中，由于发酵菌种种类复杂，各种菌种代谢利用的物质各不相同。为了发挥发酵技术在天然产物提取中的优势，菌种的选择是关键。选择菌种时要考虑菌种的遗传性能可以保持稳定；菌种本身无毒，也不会产生有毒物质；菌种与天然产物共存时能正常生长。其次，菌种数量和发酵温度、湿度、含氧量等环境因素对发酵过程都会产生较大影响。柏倩等[18]在进行银杏叶发酵工艺优化时发现，温度和接种量对发酵过程的影响极显著，pH值和发酵温度对发酵过程的影响具有交互作用。同时发酵技术能否实现规范化、工业化应用还依赖于质量控制指标的科学性。

1.2 生物酶处理技术

1.2.1作用机制 生物酶破坏植物细胞壁的实质主要在于对纤维素的水解作用。基于Reese等[19]在1950年提出的C1-Cx假说。Wood等[20]在1986年提出了内切和外切葡聚糖酶协同作用模型(图2)，将水解过程分成4步：1) 内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶通过协同作用共同作用于纤维素表面[21]；2) 内切葡聚糖酶通过水解β-1,4-葡萄糖苷键，截断纤维素产生新的多糖链末端；3) 外切葡聚糖酶在多糖链末端水解β-1,4-葡萄糖苷键，进一步切割多糖链产生纤维二糖；4)β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖等寡聚糖，最终将纤维素降解为葡萄糖[21-23]。然而，成熟的植物细胞中也有木质素，部分生物酶可降解木质素，如白腐真菌分泌的胞外木质素降解酶结合白腐真菌自身产生的H2O2触发一系列自由基链反应可以氧化降解木质素[24-27]，乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶和甲醇氧化酶也参与木质素降解，但是目前其作用机制尚不明确[28]。

图2 内切和外切葡萄糖酶协同作用模型Fig.2 In-line and exo-glucose synergy model

1.2.2协同预处理 生物酶预处理技术同其他物理化学预处理技术组合成协同体系，可以达到高效率降解纤维素的效果。通常情况下，物理化学预处理先于生物酶预处理，先将纤维素的致密物理结构损坏，伴随着纤维出现断裂或孔洞，其刚性及有序性降低，有助于生物酶在后期处理中占据位点。高大维等[29]采用冷冻预处理协同酶法提取灵芝中的多糖成分，提取液中多糖为1.05%，显著优于酶法提取(0.87%)。组合预处理协同技术具有良好的应用前景，其组合多样性有很大的开发空间，但其作用条件有待进一步研究和优化。

2 生物预处理技术在天然产物提取中的应用

2.1 微生物发酵技术在天然产物提取中的应用

2.1.1挥发性成分的提取 魏文浩等[30]对番石榴叶进行固态发酵处理的研究表明：红曲霉菌发酵番石榴叶促进了植物细胞中结合性多酚的释放以及黄酮糖苷的水解，大大提高了总黄酮和总酚含量，同时使得有刺激性气味的植物醇和β-石竹烯含量下降。李军集等[31]以桂叶渣为原料进行液态发酵的研究显示：发酵后桂叶渣的化学成分发生明显变化，产生了其他具有挥发性芳香气味的化学成分，如乙酸乙酯、己酸丁酯、δ-荜澄茄烯等，使无味的桂叶渣具有了芳香气味，并且发酵作用能够有效地降解桂叶渣中的粗纤维。梁开朝等[32]利用微生物菌株M-5对K326烟叶进行发酵处理后，烟叶提取物中苯乙醇、丁酸乙酯等天然香精、精油成分显著提高。该研究表明M-5菌株不仅可以进一步用于烟叶纯化，还具有生产香精香料的能力。张笮晦等[33]利用微生物菌株XJ26的发酵液处理肉桂叶成功提取了肉桂醛等桂叶精油成分，并且在最优工艺条件下，肉桂醛、香豆素和邻甲氧基肉桂醛的得率分别为1.40%、0.73% 和0.92%，其中甲氧基肉桂醛的含量得率高于常规水蒸气蒸馏法(0.11%)[34]。

2.1.2非挥发性成分的提取 天然产物中的非挥发性成分往往存在结构复杂、含量低的特点，因此传统提取方式无法满足天然产物开发的需求。随着生物技术的日益发展，发酵技术为解决这一问题提供了帮助。苏贵龙等[35]采用非解乳糖链球菌FGM对黄芪的根、茎和叶进行发酵处理，研究表明该发酵技术可显著提高黄芪根和茎中活性多糖、皂苷和黄酮的提取率。化洪苓[36]用红曲霉等对刺五加叶进行固态发酵配合超声波辅助提取技术从刺五加叶中提取黄酮，研究表明黄酮质量分数较发酵前提高32.37%。刘超等[37]使用酵母菌发酵黄芪后进行提取，发现酵母菌发酵处理后提取液中总黄酮的质量浓度为0.89 g/L，相对于传统水煎法有一定程度的提高。孙海等[38]利用复合酶解-酵母发酵对毛木耳进行预处理，回流提取毛木耳多糖得率为3.43%。

2.1.3毒性成分的降解 天然产物提取过程中伴随着毒性成分的产生，包括毒性生物碱、毒性内酯、刺激性芳香羧酸等。微生物发酵过程会将部分有毒成分分解转化，从而降低天然产物的毒副作用。王身艳[39]研究表明扇菇菌液态发酵草乌，促使剧毒的乌头碱、中乌头碱以及次乌头碱含量明显降低，从而降低提取物毒性。邱海龙[40]使用扇番菌发酵番荔枝子，使提取液中邻双四氢呋喃内酯的含量降低，间双四氢呋喃内酯的含量升高，从而降低整体毒性。

2.1.4高活性成分的产生 在发酵预处理过程中，微生物自身代谢产物会直接作用于部分天然产物，将其分解或修饰从而产生新的高活性化合物。因此，发酵技术能起到提高天然产物生物活性的效果。潘扬等[41]研究了马钱子经朱红栓菌固态发酵后提取所得主要生物碱的化学成分，研究发现：相较于未经发酵提取液，经发酵预处理的提取液中新增了4种成分，利用化学结构可以推断新增成分为原有吲哚生物碱衍生而来；新增成分不仅保持了原型化合物的抗炎活性，且使其毒性明显降低。

2.2 生物酶预处理技术在天然产物提取中的应用

潘映桥等[42]以响应面法优化了酶辅助水蒸气蒸馏法提取千层金精油的工艺。该研究通过果胶酶和纤维素酶的协同作用，分解千层金的细胞壁而释放出植物精油，将千层金精油得率从0.91%(水蒸气蒸馏法)提高至3.96%，解决了千层金精油水蒸气蒸馏提取法产率低的弊端。张雪松等[43]采用β-葡萄糖苷酶-果胶酶复配对桂花进行酶处理，然后采用溶剂法提取桂花精油。该方法使精油得率相比未加酶的1.77%提高了55.37%，所得桂花精油的有效成分种类也同步增加，解决了水蒸气蒸馏法高温破坏植物细胞热敏感成分的问题。丛赢[44]利用酶辅助提取油樟精油的研究表明混合酶预处理的油樟叶片下表皮表面损伤严重，气孔几乎不可见，因此减少了有效成分溶出阻力，对细胞壁的破坏更加彻底，使得酶辅助-水蒸气蒸馏法提取油樟精油的得率(4.33%)是未经酶预处理组的1.5倍。徐兴堂等[45]分别采用半纤维素酶、纤维素外切酶、纤维素内切酶及混合酶对兴安落叶松针叶预处理后提取其精油，研究表明混合酶组预处理长安落叶松针叶后精油得率最高，为1.70%，相比未经酶预处理组提高了38.20%。

对于天然产物中的非挥发性成分，传统的溶剂提取法普遍存在耗时长、提取效率低的缺点。为了提高提取效率，生物酶预处理技术已经广泛应用于天然产物中的非挥发性成分的提取。李佳妮等[46]将酶解辅助超声波提取法应用于藜麦多糖的提取，研究表明：纤维素酶能够酶解藜麦细胞壁，超声波的空化作用进一步促进细胞破碎，最终促使多糖的提取率(68.08%)比单一采用超声波提取增加1.5倍。孟永海等[47]使用果胶酶预处理白术药材后再进行超声波提取，使白术总黄酮提取得率(3.485 mg/g)是无酶预处理的1.7倍。穆易君等[48]用纤维素酶预处理菠菜后再进行超声波提取，研究表明：该方法对菠菜中总黄酮的提取得率(15.56%)比超声波辅助提取的得率高出2.51%。杨红艳等[49]用果胶酶酶解预处理加超声波促进提取的方法从黄连中提取盐酸小檗碱，提取率为96.30%，与传统提取方法相比，有效提高了盐酸小檗碱的提取率，节约了提取时间。生物酶预处理技术在醇、酯、黄酮等多类天然产物的提取中都有应用，具体见表1(按提取物化学成分分类)。同时，该技术与多种提取手段结合后都有助于提取率的提高。

表1 生物酶预处理技术在天然产物提取中的应用Table 1 Application of biological enzyme pretreatment technology in natural product extraction

续表1

综上所述，生物酶辅助技术的主要优势为：1)生物酶辅助技术促进后续提取过程中提取效率的提高，对比直接提取，可以极大地缩短提取时间；2)生物酶预处理过程条件温和、不存在或极少存在逆反应；3)生物酶用量可以准确控制，并且反应过程专一性强，因此可以有序地控制整个预处理过程；4)商业化生产的生物酶种类明确，作用机制清晰，可根据实际需求进行筛选、组合。

生物酶辅助技术相较于发酵技术，能够专业、科学地控制生物酶用量，避免了菌株被抑制生长的问题，弥补了微生物发酵技术的不足。但是，目前已经实现商业化生产的生物酶种类有限，因此生物酶辅助技术不能完全取代发酵技术。

3 展 望

近几年天然产物在医药、食品、日用品等方面的应用越来越受认可。天然产物的提取分离是天然产物开发利用的前提，也是保证天然产物得率和品质的关键步骤。随着多学科的相互渗透和交叉，生物技术研究与天然产物研究的结合日益密切，微生物发酵技术和酶辅助技术已经开始作为生物预处理手段，应用于天然产物的提取分离。生物预处理技术能影响到天然产物利用率、化学成分和生物活性。目前存在的问题在于缺少先进的技术支持与规范的操作标准，这也是生物预处理重点研究和发展的方向。随着天然产物应用范围的不断扩大，天然产物开发的产业不断发展，生物预处理技术在肉桂、油樟等大宗植物资源及其产物研究中将占有越来越重要的地位。