翟兆兰， 吕 仆， 赵 平， 宋湛谦， 商士斌， 饶小平,3*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京210042； 2.西南林业大学 西南地区林业生物质资源高效利用国家林业局重点实验室，云南 昆明 650224； 3.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091)

木材作为一种可再生生物质材料，具有无毒、无污染、美观、易加工等优点，被广泛地应用于建筑和装修等领域。但是木材含有丰富的纤维素，在合适的温度和湿度下为木材腐朽菌和霉菌的生长提供了养分，导致其很容易受虫菌侵蚀而腐朽，进而使得木材的使用寿命缩短，造成木材经济价值和使用价值的严重损失[1-3]。因此，木材防腐、防霉技术的研究和开发一直被广泛关注。目前，虽然防腐效果好的防腐剂种类较多，但通常具有较大的毒性，会造成严重的环境污染和安全问题，限制了其应用领域。天然木材防腐剂具有毒性小、污染少、分散均匀、不易流失、可循环利用和防腐抗菌性能良好等优点，因此，天然木材防腐剂研究对提高木材制品的安全性、环保性具有重要意义[4]。

植物次生代谢产物是由植物体内有机化合物的初生代谢途径衍生而来，是植物在长期进化中与环境相互作用的结果[5]，分为萜类、酚类、含氮化合物、炔类和有机酸类等，可用作杀菌剂、杀虫剂、抗癌活性成分，对环境和人畜均无害，是一类理想的生物活性产品[6-8]。松香是由松树树脂道分泌的松脂经蒸馏得到的二萜类植物次生代谢产物，产量丰富。松香的主要成分树脂酸含有独特的三环二萜氢化菲环结构，该结构使得松香具有多个手性中心和良好的生物活性[9-10]。并且松香树脂酸含有双键和羧基2种官能团，易于进行化学改性，可制备多种不同生物活性的松香衍生物[11-12]。Li等[13]以松香、丙烯酸和二乙烯三胺为原料合成松香基酰胺，当其质量浓度为64 g/L时，即可对彩绒革盖菌实现Ⅰ级防腐(木材质量损失率<10%)；质量浓度为32 g/L时，对密粘褶菌实现Ⅰ级防腐。Chen等[14]以松香、富马酸、环氧氯丙烷和三乙胺为原料合成松香季铵盐化合物，其对变色栓菌、白腐真菌和白茅内生菌均有良好的抑菌效果。Lin等[15]合成的马来松香基二硫脲化合物，对苹果轮纹病菌的最高抑制率为66.9%。Chen等[16]以脱氢枞酸为原料合成了16种新型噻唑烷酮类化合物，当质量浓度为0.05 g/L时，部分化合物对玉米赤霉菌的抑制率达91.3%，表现出显著的抑菌活性，与商业抑菌药物嘧菌酯效果相当。不同类型的松香衍生物对木材腐朽真菌及植物病原真菌均表现出较好的抑菌活性，但大多研究报道停留在衍生物的抑菌性能筛选，对结构与性能的关系分析较少。本研究探讨了松香改性产物脱氢枞酸、脱氢枞胺、脱氢枞酸酰胺衍生物和脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物对6种会引起霉变或腐变的不同植物病原真菌的抑菌活性，探索化合物结构的改变对抑菌性能的影响，进一步研究了时间和质量浓度对抑菌活性的影响，以期筛选出抑菌活性高的松香衍生物。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

脱氢枞酸(1)、脱氢枞胺(2)、脱氢枞酸酰胺衍生物(3a～3m)和脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物(4a～4i)，自制，根据文献[17]的方法合成及提纯，结构式如图1所示。灰葡萄孢(Botrytiscinerea) CGMCC 3.3790、腐皮镰孢(Fusariumsolani) CGMCC 3.2889、禾谷镰孢 (Fusariumgraminearum) CGMCC 3.4733、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum) CGMCC 3.3633、芸苔链格孢(Alternariabrassicae) CGMCC 3.7805和采绒革盖菌 (Coriolusversicolor) CFCC 5336这6种供试植物病原真菌由中国普通微生物菌种保藏管理中心和中国林业微生物菌种保藏管理中心提供。无水乙醇、葡萄糖、琼脂和放线菌酮，均为分析纯；蒸馏水、75%消毒酒精和95%酒精，实验室自制。

图1 脱氢枞酸和脱氢枞基含氮衍生物的分子结构示意图Fig.1 Molecular structure of dehydroabietic acid and dehydroabietyl nitrogen derivatives

SW-CJ-1FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HVE-50高压灭菌锅，华粤行仪器有限公司； LG-520(D)医药专用柜，浙江华美电器制造有限公司；PQX-380D多段可编程人工气候箱，宁波东南仪器有限公司。

1.2 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的制备

准确称取马铃薯200 g，洗净削皮，切成小块。电磁炉将蒸馏水加热至100 ℃，加入准备好的马铃薯并不断搅拌，防止粘锅，待马铃薯煮至用水轻压易碎，滤除马铃薯残渣。将锅洗净，将马铃薯滤液倒入锅中，并用小火加热至沸腾，缓慢加入20 g葡萄糖，搅拌至葡萄糖完全溶解，再缓慢加入18 g琼脂，快速搅拌，防止粘锅，减小火力，待液体澄清透明，关火，冷却至室温，即得马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。将制备好的PDA培养基倒入量杯中，最终倒入备好的锥形瓶中，密封瓶口。

1.3 病原真菌活化

将洗净的培养皿、接种针和PDA培养基放入高压灭菌锅中，0.1 MPa、121 ℃条件下灭菌22 min，将灭菌后的培养基及器具放入超净工作台，紫外灯照射15 min，关闭紫外灯，吹风10 min；将未凝固的培养基倾倒至空皿，每皿倒入约20 mL，放平，待完全冷凝。用接种针将保存于试管中的病原真菌菌丝挑出，采用划线法将菌丝接种于上述培养基平板上，不要划破琼脂，接种完成后用封口膜将皿口密封以防止外部污染进入；标记接种菌的名称和日期，将接种完毕的真菌平板放入28 ℃恒温培养箱，避光培养至有明显菌落。

1.4 抑菌活性测定

1.4.1初步测定 采用生长速率法测定样品溶液对病原真菌的抑制活性。准确称取36 mg样品，用无水乙醇定容至10 mL，配制质量浓度为3.6 g/L的待测样液。在超净工作台中，用灭菌枪头移取9 mL待测样液，用0.22 μm无菌滤头过滤后与171 mL、40 ℃的PDA培养基轻摇混和均匀。每个培养皿中倒入含样品的PDA培养基10 mL，设置每个培养皿中样品的最终质量浓度为180 mg/L，转动培养皿使培养基均匀平铺，标记，冷却凝固备用。

以无水乙醇为溶剂对照，以与待测液相同质量浓度的放线菌酮水溶液为阳性对照，以纯PDA培养基为空白对照，每个样品设置3组平行实验。溶剂对照与阳性对照同上操作。

接种已活化好的病原真菌，所有病原真菌在同一天内接种完毕。接种完毕放入培养箱培养3～10 d，培养至第2、 4、 6、 8、 10 d时，用十字交叉法测量病原真菌的菌落生长直径，并记录数据，抑制率计算公式如下：

式中：I—抑制率，%；D0—空白对照组平均直径，mm；Ds—处理组平均直径，mm。

1.4.2活性较好样品的进一步测定 根据初步测定的结果，对活性较好的样品进行进一步抑菌活性测定。采用二倍稀释法制备样品的最终质量浓度分别为90、 45、 22.5、 11.25 mg/L，同样以无水乙醇为溶剂对照，以与待测液相同质量浓度的放线菌酮水溶液为阳性对照，以纯PDA培养基为空白对照。同一个样品在一个质量浓度梯度下分别接种灰葡萄孢、采绒革盖菌、腐皮镰孢、尖孢镰孢、芸苔链格孢、禾谷镰孢6种病原真菌，每个实验设置3个重复组，在28 ℃的培养箱中培养10 d，期间测量每种菌的生长直径，计算平均直径和抑制率。

2 结果与分析

2.1 不同类型脱氢枞基含氮衍生物的抑菌活性

2.1.1初步测定结果 化合物1、2、3a～3m和4a～4i对不同病原真菌的抑制活性如表1所示。

由表1可知，脱氢枞酸(1)仅对芸苔链格孢的抑制率大于60%，对灰葡萄孢的抑制率大于40%，而对其他4种病原真菌的抑制率均小于40%。脱氢枞胺(2)对灰葡萄孢、腐皮镰孢、芸苔链格孢、禾谷镰孢和尖孢镰孢的抑制率均大于65%，并且脱氢枞胺对6种病原真菌的抑制率均大于脱氢枞酸，表明脱氢枞胺具有较好的抑菌活性，且远远好于脱氢枞酸。脱氢枞酸酰胺衍生物(3a～3m)对6种病原真菌的抑制率均较低，仅脱氢枞酸酰胺(3a)对芸苔链格孢的抑制率大于80%，3j对灰葡萄孢的抑制率大于90%。说明脱氢枞酸酰胺衍生物对6种病原真菌的抑制活性较低。脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物(4a～4i)中的每个样品至少对2种病原真菌的抑制率能达70%以上，并且其中4d对灰葡萄孢和芸苔链格孢的抑制率为100%，4h对灰葡萄孢、腐皮镰孢和芸苔链格孢的抑制率为100%，与阳性对照放线菌酮的抑制活性相当。上述结果表明脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物对6种病原真菌具有较好的抑菌活性，且远远优于脱氢枞酸酰胺衍生物。因此后续实验选用抑菌活性较好的4a～4i对6种不同病原真菌的抑制活性进一步分析。

表1 脱氢枞酸和脱氢枞基含氮衍生物的抑菌活性(培养2天)Table 1 Antibacterial activities of dehydroabietic acid and dehydroabietyl nitrogen derivatives (cultivated 2 d)

2.1.2化合物4a～4i的抑菌活性 化合物4a对灰葡萄孢的抑制率大于90%，对禾谷镰孢和尖孢镰孢的抑制率大于80%，但对采绒革盖菌的抑制率较差，小于20%。对比化合物4a，在苯环的对位引入甲氧基、氟原子和氯原子的4b、4g和4h对灰葡萄孢、腐皮镰孢、芸苔链格孢、禾谷镰孢和尖孢镰孢(4g除外)的抑制率均大于80%，具有突出的抑菌活性。此外，化合物4b、4g和4h对采绒革盖菌的抑制率对比化合物4a均有较大的提高，表明在苯环的对位引入甲氧基、氟原子和氯原子增加了脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物的抑菌活性。对比化合物4g，化合物4f对灰葡萄孢和禾谷镰孢同样有较好的抑制活性，抑制率大于90%，但对腐皮镰孢、芸苔链格孢和尖孢镰孢的抑制活性较差，表明脱氢枞胺(对氟)苯甲醛Schiff碱的抑菌活性比脱氢枞胺(间氟)苯甲醛Schiff碱的好。脱氢枞胺水杨醛Schiff碱(4c)对灰葡萄孢和芸苔链格孢的抑制率大于90%，脱氢枞胺(对氯)水杨醛Schiff碱(4d)对灰葡萄孢和芸苔链格孢的抑制率均为100%，与放线菌酮对灰葡萄孢和芸苔链格孢的抑制活性相当，同样表明氯原子的引入增加了脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物的抑菌活性。此外，化合物4d对采绒革盖菌具有较好的抑制活性，抑制率均大于80%。综上所述，脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物苯环的对位被氯原子取代的化合物4d和4h对6种病原真菌抑制活性最好，对位被氟原子和甲氧基取代的化合物4g和4b次之，在间位被氟原子取代的化合物4f的抑菌效果也较好，说明含有卤素原子取代的脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物对6种病原真菌具有突出的抑制活性。

2.2 时间对脱氢枞基含氮衍生物抑菌活性的影响

选取对6种病原真菌具有较好抑制活性的含卤素的脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物，脱氢枞胺(对氯)水杨醛Schiff碱(4d)、脱氢枞胺(间氟)苯甲醛Schiff碱(4f)、脱氢枞胺(对氟)苯甲醛Schiff碱(4g)和脱氢枞胺(对氯)苯甲醛Schiff碱(4h)，测定了其质量浓度为180 mg/L时在不同时间下对6种病原真菌的抑制活性，结果如图2所示。

a.4d； b.4f； c.4g; d.4h图2 脱氢枞基含氮衍生物在不同时间下的抑菌活性Fig.2 Inhibitory activity of dehydroabietyl nitrogen derivatives at different time

化合物4d对灰葡萄孢和芸苔链格孢在不同时间内均具有突出的抑制活性，抑制率为100%，对腐皮镰孢、禾谷镰孢和尖孢镰孢的抑制活性随时间的增加而降低，2天时的抑制活性最高，对采绒革盖菌的抑制活性随时间的增加先升高后降低，第4天时的抑制活性最好。化合物4f对灰葡萄孢、芸苔链格孢、禾谷镰孢和采绒革盖菌的抑制活性均随时间的增加而降低，对腐皮镰孢和尖孢镰孢的抑制活性随时间的增加先升高后降低。化合物4g对灰葡萄孢、腐皮镰孢、芸苔链格孢和禾谷镰孢的抑制活性受时间的影响较小，在测试时间内抑制率均大于80%，4g对尖孢镰孢和采绒革盖菌的抑制活性均随时间的增加而升高，第10天时的抑制活性最好。化合物4h对灰葡萄孢、腐皮镰孢、芸苔链格孢、禾谷镰孢和尖孢镰孢的抑制活性在测试时间内变化较小，抑制率均大于80%，对采绒革盖菌的抑制活性随时间的增加先增加后趋于不变。

2.3 质量浓度对脱氢枞基含氮衍生物抑菌活性的影响

研究了化合物4d、4f、4g和4h10天时在不同质量浓度下对6种病原真菌的抑制活性，结果见图3。由图可知不同质量浓度的4f、4g和4h对灰葡萄孢的抑菌率均大于95.00%，具有突出的抑制活性，抑制活性受质量浓度的影响较小，但是质量浓度对4d对灰葡萄孢的抑菌活性影响较大，11.25和45 mg/L时的抑制率为100.00%，22.5 mg/L时的抑制率仅为52.00%。4种样品对尖孢镰孢均具有较好的抑制活性，抑制活性受质量浓度的影响较小，不同质量浓度下的抑制率均大于70%，而对腐皮镰孢、禾谷镰孢、尖孢镰孢和采绒革盖菌的抑制活性受质量浓度的影响较大。整体上，化合物4d对6种病原真菌的抑制活性最差，这可能是因为4d的苯环上还含有羟基，羟基的引入降低了含卤原子的脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物的抑菌活性。并且，4d对6种病原真菌的抑制率随质量浓度的变化趋势不一致，受质量浓度的影响较大，但均在11.25 mg/L的抑制率较高。化合物4f、4g和4h对不同的植物病原真菌的抑制率随质量浓度的变化趋势一致，4f在22.5 mg/L对6种病原真菌的抑制率最高，并且均大于95%，表明4f在22.5 mg/L时具有突出的抑菌性。而4g对6种病原真菌的抑制率随质量浓度的增加先降低后增加，在22.5 mg/L时抑制率最低，在其他质量浓度下有较好的抑制活性(抑制率大于70%)。4h对6种病原真菌的抑制率随质量浓度的增加先降低后增加再降低，在45 mg/L时的抑制率较高。上述结果表明卤原子的取代位置和类型均影响脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物在不同质量浓度下的抑菌活性和最佳抑制活性的质量浓度。

a.灰葡萄孢B. cinerea; b.腐皮镰孢F. solani; c.禾谷镰孢F. graminearum; d. 尖孢镰孢F. oxysporum;e.芸苔链格孢A. brassicae; f. 采绒革盖菌C. versicolor图3 脱氢枞基含氮衍生物在不同质量浓度下的抑菌活性Fig.3 Inhibitory activity of dehydroabietyl nitrogen derivatives at different mass concentrations

3 结 论

3.1采用平板计数法研究了脱氢枞酸和23种脱氢枞基含氮衍生物对6种病原真菌的抑菌活性，结果表明：脱氢枞胺的抑菌活性远远好于脱氢枞酸，脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物(4a～4i)的抑菌活性远远优于脱氢枞酸酰胺衍生物(3a～3m)。在脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物苯环上引入卤素原子较强地增加了其抑菌活性。当质量浓度为180 mg/L时，脱氢枞胺(对氯)水杨醛Schiff碱(4d)对灰葡萄孢和芸苔链格孢的抑制率均为100%，脱氢枞胺(对氯)苯甲醛Schiff碱(4h)对灰葡萄孢、腐皮镰孢和芸苔链格孢的抑制率为100%，脱氢枞胺(间氟)苯甲醛Schiff碱(4f)和脱氢枞胺(对氟)苯甲醛Schiff碱(4g)在不同培养时间对部分病原真菌的抑制率也达到100%，与阳性对照物放线菌酮的抑制活性相当。

3.2进一步研究了化合物4d、4f、4g和4h在不同质量浓度下对6种病原真菌的抑菌活性。结果表明：4种化合物在不同质量浓度下对灰葡萄孢和芸苔链格孢具有较好的抑制活性，大于70%(4d在22.5 mg/L时除外)。苯环上卤原子的取代位置和类型均会影响脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物在不同质量浓度下的抑菌活性和最佳抑菌活性的质量浓度。