周巧 刘健 朱艳 潘喻珍 杨佳 周婧 吴云 王振亚 尹志勇

【摘 要】目的：探讨佐剂性关节炎大鼠氧化应激与AMPK/Foxo3a轴的关系及健脾化湿、清热通络法对其影响。方法：将70只大鼠隨机分为空白对照组，模型对照组，黄芩清热除痹胶囊（HQC）低、中、高剂量组，来氟米特组，黄芪甲苷组，每组10只。除空白对照组外，其余各组采用足跖皮内注射完全佐剂致炎制成佐剂性关节炎模型。致炎后第19天始用药，连续给药30 d，每日1次。空白对照组与模型对照组以质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃，HQC各剂量组、来氟米特组、黄芪甲苷组分别给予相应剂量的药物。观察各组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数;酶联免疫吸附法检测白细胞介素（IL）-1β、IL-4、过氧化脂质（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（TAOC）的表达;Western blot检测各组AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表达。结果：与其他各组比较，HQC中剂量组体质量较高，关节炎指数降低明显（P < 0.05）; IL-4水平升高明显，IL-1β下降明显，且显著优于黄芪甲苷组（P < 0.05）。来氟米特组SOD、TAOC水平明显低于HQC中剂量组，来氟米特组、黄芪甲苷组MDA、LPO水平高于HQC中剂量组（P < 0.05）。HQC中剂量组AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达水平较黄芪甲苷组、来氟米特组明显升高（P < 0.01或P < 0.05）。结论：健脾化湿、清热通络法可以通过调节氧化应激介导的AMPK/Foxo3a通路，提高抗氧化能力，进而恢复机体免疫稳态。

【关键词】 佐剂性关节炎;健脾化湿、清热通络法;氧化应激;AMPK/Foxo3a轴;大鼠

Study on the Mechanism of Jianpi Huashi，Qingre Tongluo Method in Improving Oxidative Stress State of Adjuvant Arthritis Rats Based on AMPK / FOXO3a Axis

ZHOU Qiao，LIU Jian，ZHU Yan，PAN Yu-zhen，YANG Jia，ZHOU Jing，WU Yun，WANG Zhen-ya，YIN Zhi-yong

【ABSTRACT】Objective：To investigate the relationship between oxidative stress and AMPK/FOXO3a axis in rats with adjuvant arthritis and the effect of Jianpi Huashi Qingre Tongluo method（a method of invigorating spleen，resolving dampness，clearing heat and dredging collaterals） on it.Methods：Seventy rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium and high dose groups of Huangqin Qingre Chubi Jiaonang（黄芩清热除痹胶囊，HQC），a leflunomide group，an astragaloside group，ten rats in each group.Except the blank control group，the other groups were made into adjuvant arthritis models by intradermal injection of complete adjuvant.On the 19th day after inflammation，the drug was administered continuously for 30 days，once a day.The blank control group and model control group were intragastrically administered with 0.9% sodium chloride solution.The corresponding doses of drugs were given to each dose group of HQC，the

leflunomide group and the astragaloside group.The swelling degree and arthritis index of each group were observed.The expressions

of IL-1β，IL-4，LPO，MDA，SOD and TAOC

were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Western blot was used to detect the expressions of AMPKα1，p-AMPKα1，FoxO3a，p-FoxO3a and MnSOD.Results：Compared with other groups，the medium dose group of HQC had higher body weight and lower arthritis index（P < 0.05）;IL-4 level increased and IL-1β decreased significantly，which was significantly better than the astragaloside group（P < 0.05）.The levels of SOD and TAOC in the leflunomide group were significantly lower than those in the middle dose group of HQC，while MDA and LPO levels in the leflunomide group and the astragaloside group were higher than those in the middle dose group of HQC（P < 0.05）.The protein expression levels of AMPKα1，p-AMPKα1，FoxO3a，p-FoxO3a and MnSOD in the medium dose group of HQC were significantly higher than those in the astragaloside group and the leflunomide group（P < 0.01

or P < 0.05）.Conclusion：Jianpi Huashi Qingre Tongluo method can improve antioxidant capacity and restore immune homeostasis by regulating the AMPK/Foxo3a pathway mediated by oxidative stress.

【Keywords】 adjuvant arthritis;Jianpi Huashi，Qingre Tongluo method;oxidative stress;AMPK/Foxo3a axis;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种临床表现多样化的系统性自身免疫性疾病[1]。自由基参与RA关节滑膜的炎性病变和骨质的破坏。过量的氧自由基抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡[2]。AMPK/FoxO3a途径是其中一条抗氧化通路[3]。本课题组在长期理论研究与临床实践基础上提出了RA“从脾论治”观点[4]。黄芩清热除痹胶囊（HQC）由黄芩、栀子、威灵仙、薏苡仁、桃仁组成，具有清热利湿、健脾益气、祛风通络的功效。本研究通過观察HQC干预后对佐剂性关节炎（AA）大鼠外周血单个核细胞（PBMC）中氧化应激指标、细胞因子以及AMPK/FoxO3a通路表达水平的影响，探讨HQC的作用及可能的机制，为健脾化湿、清热通络法治疗RA提供实验

依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性6周龄SD大鼠70只，体质量（150±20）g。实验动物来源于安徽医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号SCXK（皖）2019-001。

1.2 实验材料 药品：HQC（每粒胶囊含生药浸出物0.4 g，安徽中医药大学第一附属医院制剂中心生产，专利号ZL201110095718.X）;来氟米特（美罗药业股份有限公司，生产批号1702011，规格

10 mg）;黄芪甲苷（每瓶20 mg，纯度≥98%）。

试剂：弗氏完全佐剂（美国Sigma公司）;白细胞介素（IL）-1β、IL-4、过氧化脂质（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（TAOC）的ELISA检测试剂盒及其配套试剂（美国R&D公司）;兔抗AMPKα1、兔抗p-AMPKα1、兔抗FoxO3a、兔抗p-FoxO3a、兔抗MnSOD（Abcam公司），HRP标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）、山羊抗兔IgG、β-Actin（北京中杉公司）。足趾容积测量仪（成都泰盟软件有限公司，PV-200型）;MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Beyotime公司）;淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物科技公司）;体积分数为10%的胎牛血清（FBS）DMEM完全培养基：50 mL的FBS加入450 mL DMEM培养基，再加入青链霉素5 mL，置4 ℃保存备用。

1.3 研究方法

1.3.1 动物模型复制及给药 将70只大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，HQC低、中、高剂量组，来氟米特组，黄芪甲苷组，每组10只。大鼠适应性饲养7 d后，除空白对照组外，向每只动物右足跖皮内注射佐剂致炎，注射量为0.1 mL·（100 g）-1，制成佐剂性关节炎模型。造模前每只大鼠右后足趾容积，作为致炎前足趾基础容积。模型成功判定标准：进行关节炎指数（AI）评分，在首次注射弗氏完全佐剂后16 d，AI评分 > 4分，单侧右足外踝以下隆起的体积 > 1.6 mL者为造模成功。

1.3.2 给药及PBMC的分离 致炎后第19天开始给药，剂量相当于临床用量的10倍。空白对照组和模型对照组：给予生理盐水灌胃1 mL·（100 g）-1，

每日1次。将HQC去除胶囊壳，加生理盐水，配制成混悬液（每毫升含药量0.04 g，即0.4 g·kg-1）。

按1 mL·（100 g）-1的比例，HQC低、中、高剂量组分别给予混悬液200，400，800 mg·kg-1·d-1灌胃。来氟米特组：每毫升含来氟米特1 mg，给药剂量为10 mg·kg-1·d-1。黄芪甲苷组：每毫升含黄芪甲苷6 mg，给药剂量为60 mg·kg-1·d-1。各组均连续给药30 d。于末次服药1 h后，上述各组大鼠予以质量分数为10%的水合氯醛麻醉，无菌操作下腹主动脉采血，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）按1∶1稀释全血，轻轻混匀;将稀释好的样本沿管壁缓慢加至含有5 mL淋巴细胞分离液的离心管（出现分层，勿混匀），放入水平离心仪中，以1500 r·min-1离心15 min，离心半径13.5 cm;离心后管内见分层后，滴管吸取白色雾状单个核细胞，移至干净离心管中;含单个核细胞的培养管中加入PBS混匀（1∶1），以800 r·min-1离心8 min，离心半径13.5 cm，清洗2次;用体积分数为10%的FBS DMEM完全培养基悬浮沉淀细胞，吸管吹打混匀，放入37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱中孵育备用。

1.3.3 细胞培养 细胞传代培养：倒置显微镜下观察各组PBMC，当汇合成片（约90%、95%）时，便可进行传代培养。弃旧培养液，用PBS冲洗细胞

3次，加入胰蛋白酶l mL，37 ℃静置0.5～2 min，

倒置显微镜下观察，细胞变圆、漂浮，轻轻摇晃细胞瓶壁两侧，使细胞全部消化，立即加入等量的对应各组的培养基终止消化。倒入15 mL离心管中，1000 r·min-1离心5 min，离心半径13.5 cm，重新加入新培养液，吹打细胞，形成细胞悬液，使其散开，可传代分瓶培养或冻存备用。细胞计数：取细胞混悬液10 μL，移液枪打匀，2～3 min后在计数板计数，倒置显微镜下观察细胞，并计数。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠足跖肿胀度、AI评分的测算 于造模

前1 d、致炎后给药前1 d、第49天（即给药后第30天）测量各组大鼠右后足跖容积，计算各组大鼠足跖肿胀度[5]。足跖肿胀度=（Vt-Vn）/Vn×100%（Vn、Vt分别代表致炎前后足跖容积）。AI评分计算：致炎后开始观察并记录全身关节病变程度。全身关节病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3只肢体病变程度累积积分，计算AI评分[5]，各个关节的积分累计，即为每只大鼠的AI评分。

1.4.2 四甲基偶氮唑盐（MTT）实验 设空白对照组（无细胞），阴性对照组（即体积分数为10%的FBS，HQC低、中、高剂量组的培养基）。取对数生长期细胞以1×105 个·mL-1密度接种于96孔

培养板中，使每孔的终体积为100 μL，每组设

6个复孔，常规培养于37 ℃、含体积分数为5%的CO2气体的培养箱中。孵育12，24，48 h后，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃培养箱中继续培养4 h后，弃上清再加入DMSO 150 μL，酶标仪49 nm波长测定各孔的吸光度（OD490），每次实验重复3次。按照下列公式计算细胞抑制率，细胞抑制率（%） = （Ac-As）/（Ac-Ab） × 100%。其中As为实验孔（含有细胞、DMSO、含药血清），Ac为阴性对照孔（含有细胞、DMSO、胎牛血清），Ab为空白对照孔（不含细胞，含DMSO）。

1.4.3 ELISA检测各组IL-1β、IL-4、SOD、TAOC、

MDA、LPO表达 取对数生长的细胞，按105个·mL-1

浓度接种于96孔板细胞培养板中，每孔加100 μL细胞液。24 h后取上清液移入消毒的EP管中，标记设孔。空白孔加100 μL，设标准孔10孔，依次加入不同浓度的标准品，每孔加液量100 μL。

待测样品孔中加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。再将样品加于酶标板孔底部，酶标板加上覆膜，37 ℃温育30 min;弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次;每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。重复上述温育、洗涤步骤;每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，37 ℃避光显色15 min;每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）;450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

1.4.4 Western blot检测各组AMPKα1、p-AMPKα1、

FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表达 取对数生长的细胞，按105个·mL-1浓度接种于6孔板细胞培养板中，每孔加2 mL细胞悬液。加入细胞裂解液，BCA法测定总蛋白含量。按照1∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室温封闭2 h后，按照合适的比例用一抗稀释液进行稀释（MnSOD抗体属性为兔抗1∶300稀释，AMPKα1抗体属性为兔抗1∶2000稀释，p-AMPKα1抗体属性为兔抗1∶1000稀释，FoxO3a抗体属性为兔抗1∶500稀释，p-FoxO3a抗体属性为兔抗1∶500稀释，体积分数为10%的分离胶）。二抗孵育参考二抗说明书，按照相应比例1∶10 000（p-FoxO3a、FoxO3a）;1∶2000（p-AMPKα1、AMPKα1）;1∶5000（MnSOD）用二抗稀釋液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。使用ECL超敏发光试剂盒检测蛋白。用Image J软件分析条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白的相对表达量为参数进行半定量统计分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验;不符合

正态分布资料采用Wilcoxon秩和检验。以P < 0.05

为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同剂量HQC含药血清在不同时间点对PBMC的影响 MTT结果表明，与空白对照组同期比较，HQC中、高剂量组OD值下降，且中剂量组OD值降低明显（P < 0.01或P < 0.05）。各组浓度含药血清对PBMC的抑制作用在培养24 h最强。故本实验取HQC中剂量含药血清为最佳含药血清，24 h为最佳作用时间。见表1。

2.2 各组大鼠体质量、足趾肿胀度和AI评分比较 致炎后第19天起给药。给药前与空白对照组比较，模型对照组和各治疗组大鼠足趾肿胀度和AI评分均升高（P < 0.01或P < 0.05），模型对照组与各治疗组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。连续给药30 d后，与空白对照组比较，模型对照组大鼠足趾肿胀度和AI评分升高（P < 0.01）;与模型对照组比较，各治疗组大鼠足跖肿胀度和AI评分明显降低（P < 0.01）;各治疗组比较，HQC中剂量组体质量较高，AI评分降低明显（P < 0.05）;与HQC中剂量组比较，来氟米特组大鼠体质量较低（P < 0.01），AI评分较高（P < 0.05），足趾肿胀度差异无统计学意义（P > 0.05）;黄芪甲苷组体质量、肿胀度和AI评分高于其余各组（P < 0.01或P < 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠细胞因子IL-1β、IL-4水平比较 致炎后第49天，检测各组AA大鼠血清细胞因子的变化，与空白对照组比较，模型对照组和各治疗组IL-1β水平升高，IL-4水平下降（P < 0.01）。与模型对照组比较，各治疗组IL-1β水平降低，IL-4水平升高（P < 0.01或P < 0.05）。HQC中剂量组IL-4水平升高明显，IL-1β下降明显，且显著优于黄芪甲苷组（P < 0.05）。见表3。

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收稿日期：2020-04-17;修回日期：2020-05-19