罗乐，杨陈武，敬巧，杜成超，文爱平#

川北医学院附属医院1医学影像四川省重点实验室，2妇产科，四川 南充 637000

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，好发于55～65岁女性，具有发病隐匿、恶性程度高和侵袭力强等特点[1]。近年来，虽然卵巢癌的治疗水平有所提高，但EOC患者的5年生存率仍约为30%，是妇科恶性肿瘤的首要病死原因[2]。探索EOC病理过程中的关键因子对寻找新的治疗靶点和改善患者的预后具有重要意义。Tip60蛋白属于MYST家族成员，能够介导核心组蛋白的乙酰化、分子磷酸化和泛素化，通过对细胞DNA损伤的修复和细胞信号的传导，从而负性调控肿瘤的发生。Tip60蛋白在调控基因表达、修复DNA损伤、重建染色质等领域成为当前分子生物学的研究热点[3-4]。有研究发现，Tip60蛋白的表达与神经胶质瘤的恶性程度有关，其低表达是导致神经胶质瘤患者预后差的独立危险因素[5]。然而，Tip60蛋白的表达与EOC患者的临床特征及预后的关系尚未见报道。本研究采用免疫组织化学染色法检测EOC组织中Tip60蛋白的表达情况，分析Tip60蛋白的表达与EOC患者临床特征和预后的关系，为EOC的临床治疗和预后预测提供参考依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2013年1月至2014年1月川北医学院附属医院82例EOC患者的石蜡组织标本，患者均为初诊、初治的卵巢癌患者，术前未接受过放疗、化疗等治疗，术后经病理学检查确诊。EOC患者的年龄为41～73岁，平均年龄为（59.26±6.31）岁；组织类型：低级别浆液性癌31例，高级别浆液性癌18例，黏液性腺癌21例，子宫内膜腺癌12例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期62例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移51例。选取37例卵巢良性病变患者的卵巢良性病变组织标本，患者的年龄为40～72岁，平均年龄为（58.72±6.29）岁；疾病类型：巧克力囊肿19例，单纯卵巢囊肿10例，黄体囊肿8例。另收集31例非卵巢疾病患者的健康卵巢组织标本作为对照，患者的年龄为45～73岁，平均年龄为（59.53±6.17）岁。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色方法

采用En-vision法检测各卵巢组织标本中Tip60蛋白的表达情况，将标本切片后脱蜡水化，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗5 min，洗涤3次，使用3%过氧化氢于室温孵育15 min，以封闭内源性过氧化物酶。使用蒸馏水冲洗，再用PBS洗涤5 min，洗涤3次；滴加兔抗人Tip60多抗（一抗，稀释比例为 1∶150），室温孵育 30 min，然后PBS漂洗5 min，3次；加ChemMate Envision+/HRP工作液，室温孵育30 min，PBS漂洗5 min，3次；滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂，室温孵育10 min，显色完全后终止显色。采用苏木精复染、梯度乙醇脱水，二甲苯漂洗3次，封片胶封片。采用试剂盒内的阳性标准物作为阳性对照，以PBS溶液代替一抗作为阴性对照。

1.3 免疫组织化学染色结果判定标准

每张切片随机选取5个视野计数，根据染色程度评分：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕黑色计3分；依据阳性细胞比例评分：0～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分。Tip60蛋白染色的最终评分为染色程度和阳性细胞比例的乘积，＜8分为低表达，≥8分为高表达。

1.4 治疗方案及随访

根据具体病情选择适当的手术方案，包括全子宫及双附件、转移瘤、大网膜及阑尾切除术和盆腔淋巴结清扫术等。术后1周给予紫杉醇联合卡铂化疗，每3周为1个疗程，共化疗6个疗程。对所有患者手术后每3个月通过电话或门诊随访1次，记录患者的5年生存情况，随访截至术后5年或患者死亡。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存情况的比较采用Log-rank检验；构建Cox回归模型对卵巢癌患者预后的影响因素进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tip60蛋白在不同卵巢组织中的表达情况

EOC组织中Tip60蛋白的高表达率低于良性卵巢病变组织和健康卵巢组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；良性卵巢病变组织和健康卵巢组织中Tip60蛋白的的高表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。EOC组织、良性卵巢病变组织和健康卵巢组织中Tip60蛋白的的高表达率比较，差异有统计学意义（χ2=38.299，P＜0.01）。（表1）

2.2 Tip60蛋白表达与EOC患者临床特征的关系

不同年龄、组织类型、FIGO分期、淋巴结转移情况和合并腹腔积液情况的EOC患者EOC组织中Tip60蛋白的高表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；组织学分级为G1～2级的EOC患者EOC组织中Tip60蛋白的高表达率高于组织学分级为G3级的EOC患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

2.3 Tip60蛋白的表达对卵巢癌患者生存时间的影响

82例EOC患者均完成最终随访，平均生存时间为（36.32±1.88）个月。Log-rank检验结果显示，Tip60低表达患者的中位生存时间为28.00个月，短于Tip60高表达患者的44.00个月，差异有统计学意义（χ2=5.093，P＜0.05）。Tip60低表达患者的5年生存率为19.05%（12/63），明显低于Tip60高表达患者的42.11%（8/19），差异有统计学意义（χ2=4.208，P＜0.01）。

2.4 卵巢癌患者生存影响因素的单因素分析

截至随访结束，82例卵巢癌患者中，生存20例，病死62例，卵巢癌患者的术后5年生存率为24.39%（20/82）。不同年龄、组织类型、FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移、是否存在腹腔积液和Tip60蛋白表达情况的卵巢癌患者的5年生存情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 卵巢癌患者5年生存情况影响因素的单因素分析（n=82）

2.5 卵巢癌患者生存影响因素的多因素分析

将单因素分析结果有统计学意义的因素进一步纳入Cox模型，多因素分析结果显示：FIGO分期高、组织学分级高和存在淋巴结转移是EOC患者5年生存率的危险因素（P＜0.05），Tip60高表达是EOC患者5年生存率的保护因素（P＜0.05）。（表4）

3 讨论

卵巢恶性肿瘤为女性常见的生殖系统恶性肿瘤，发生率仅次于子宫内膜癌和宫颈癌，病死率位居首位[6-7]。EOC是卵巢恶性肿瘤的常见类型，占所有卵巢恶性肿瘤的86%～90%[8]，具有恶性程度高、侵袭力强、术后易复发等特点，严重威胁女性健康。EOC的早期症状不明显，多数患者就诊时病情已发展至晚期，错失了最佳的治疗时机[9-10]。目前，卵巢癌的治疗方式包括手术和放化疗，其中，单纯手术治疗很难根治，而多数患者容易对放化疗产生耐受性，导致3年生存率仅为30%左右[11]。因此，寻找影响EOC发生和发展的关键因子有助于提高治疗效果和改善预后。

乙酰化为真核细胞中蛋白质最常见的修饰方式，乙酰化修饰对蛋白酶活性、稳定性以及DNA结合力等具有显著影响[12]。Tip60蛋白是最早采用酵母双杂交方式确定的、能够与人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）调节因子反式转录激活因子（trans-activator of transcription，TAT）结合的蛋白，相对分子量为60 kD[13]，能够介导P53、核心组蛋白等的乙酰化修饰，通过不同蛋白间的相互作用参与多条信号通路的活化，从而在细胞凋亡、基因调控以及染色体重建等过程中发挥作用。有研究发现，Tip60蛋白的表达与结直肠癌的临床分期和组织分化程度有关，且低表达的Tip60蛋白会提高结直肠癌患者对丝裂霉素、奥沙利铂等化疗药物的敏感性[14]。有报道称，Tip60主要通过核因子-Myc和核因子-κB两条信号通路参与肿瘤的发生、发展[15-16]。一方面，Tip60通过GAS41与核因子-Myc结合形成稳定复合物，调控下游基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖[17]；另一方面，Tip60能阻断核因子-κB信号通路，下调细胞膜上基质金属蛋白酶的表达，降低肿瘤细胞的黏附性，抑制肿瘤的侵袭[18]。本研究结果显示，EOC组织中Tip60蛋白的表达明显低于良性卵巢病变组织和健康卵巢组织，且Tip60蛋白的表达情况与EOC患者的组织学分级有关。进一步探讨Tip60蛋白与EOC患者生存时间的关系发现，Tip60蛋白低表达患者的5年生存率低于Tip60高表达患者，且Tip60低表达患者的中位生存时间也相对较短，提示Tip60蛋白的表达水平与EOC患者的预后有关，Tip60可作为评估患者预后的参考指标。本研究采用Cox回归模型分析EOC患者预后的影响因素，结果显示，FIGO分期高、组织学分级高、存在淋巴结转移是EOC患者5年生存状况的重要危险因素，而Tip60蛋白高表达是EOC患者5年生存状况的保护因素。

综上所述，EOC组织中Tip60蛋白的表达水平降低，且Tip60蛋白的表达与EOC患者的组织学分级有关，检测Tip60蛋白的表达情况有助于预测EOC患者的预后情况。然而，Tip60在EOC发生过程中的作用机制尚不明确，今后应深入研究，以期为EOC的临床治疗和改善患者预后提供依据。