谢俊，梁先春，唐永梁

陆军军医大学第三附属医院（野战外科研究所）肝胆外科，重庆 400042

原发性肝细胞肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是一类发生于肝细胞或肝内管细胞的恶性肿瘤，其发病率及病死率在所有恶性肿瘤中均排在前列[1-2]。大部分PHC患者在中晚期才被检查发现，因此只有极少部分PHC患者能够进行切除手术，更多的患者只能选择肝动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）进行保守治疗以延长生存时间[3-4]。TACE为中晚期PHC患者的主要治疗方式，但依然有部分患者介入效果不佳，需要反复多次介入治疗[5]，因此临床上需要一种无创、安全评估TACE疗效的方式。肿瘤特异性生长因子（tumor specific growth factor，TSGF）因为对肿瘤判断的高灵敏度而被临床用于评估肿瘤治疗效果[6]。目前研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在多种恶性肿瘤中异常表达，并且与治疗反应和疗效预测等关系密切，miRNA-214作为miRNA家族中的成员，在多种不同组织来源肿瘤中均异常表达，在肝癌细胞中，其水平显著降低[7]。本研究旨在探讨血清中TSGF、miRNA-214水平在TACE术前术后的变化情况，并分析其水平对TACE远期疗效的预测价值，为临床应用提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2015年12月陆军军医大学第三附属医院收治的需行TACE治疗的PHC患者的病历资料。纳入标准：①穿刺获取组织并经临床和病理学诊断确诊为PHC[8]；②无法进行肝癌切除术；③甲胎蛋白≥400 μg/L；④生存时间≥3个月；⑤首次进行TACE术且无手术、化疗、免疫治疗及靶向治疗史。排除标准：①合并严重心、肝、肾功能障碍；②合并其他类型恶性肿瘤；③甲胎蛋白阴性肝癌；④合并严重凝血功能障碍；⑤临床资料不完整。根据纳入、排除标准，共纳入87例PHC患者，其中男47例，女40例；年龄（42.35±10.52）岁，中位年龄49.74岁。

1.2 TACE 治疗方法及疗效评价标准

保持患者卧位并选择体右侧下肢动脉作为穿刺点，进行局部麻醉后采用Seldinger技术对动脉进行穿刺，在腹腔动脉、肝动脉、肠系膜上动脉处置管进行血管造影，找到肿瘤的明确供血动脉，并对病灶数目、血供情况、有无血管侵犯及动静脉瘘进行观察。选取5F肝管超选择插管至肝固有动脉，注入适量化疗药物及超液化碘油混合乳剂进行栓塞。进行肝动脉造影确定病灶处血供清况，效果满意后拔除导管，进行常规伤口包扎，术后给予保肝、增强免疫及对症治疗。

治疗期间根据影像学结果评价疗效[9]，复查间隔时间为4～8周。疗效评价标准：完全缓解，肝脏肿瘤完全消失且无新病灶出现；部分缓解，肝脏肿瘤最大直径减小＞30%，且维持时间超过4周；稳定，肝脏肿瘤最大直径减小≤30%，增大≤20%；进展，肝脏肿瘤最大直径增大＞20%或有新的病灶出现。病情控制=完全缓解+部分缓解+稳定。

1.3 观察指标

所有PHC患者均于TACE前1天和治疗后1个月抽取外周血5 ml于抗凝管中，离心取上清后分为两部分，一部分保存于-20℃用于TSGF测定，一部分保存于-8℃用于miRNA-214测定。TSGF测定：采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清中TSGF水平，试剂盒购自美国Santacruz公司；实验重复3次，取平均值作为最终检测结果。miRNA-214测定：按照RNA提取试剂盒中说明书操作步骤提取血清中的总RNA，提取后用紫外分光光度计检验，光密度（optical density，OD）值（A260/A280）=1.8～2.1，并用凝胶电泳检测RNA的完整性；符合标准后进行反转录cDNA合成，反转录体系（10 μl）：2×miRNA反应混合液5 μl，0.1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）1 μl，miRNA Prime Script®RT酶混合物1 μl，总 RNA 0.5 μl，去 RNA 酶 ddH2O 2.5 μl；反应条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4℃ 30 min。cDNA获取后，进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测，PCR 体系（10 μl）：SYBR®Prmix Ex TapⅡ（2×）5 μl，上游引物 0.4 μl，下游引物 0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μl，cDNA1 μl，ddH2O 3 μl，详细操作见试剂盒说明书；PCR反应条件：50℃激活聚合酶5 min，95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃15 s，内参基因采用β-actin。每个样孔设置3个复孔，取 Ct平均值进行分析，以 2-△△Ct表示相对表达量。

1.4 随访情况

患者自治疗出院后开展随访工作，治疗后1年内每3个月门诊复查1次，2年内每半年复查1次，以后至少每年复查1次，所有患者随访时间一致。随访记录生存时间及随访时状态（生存、死亡或其他）等。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve，AUC）评价血清TSGF、miRNA-214水平对TACE疗效的预测价值；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法比较生存情况。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病情控制组和病情进展组患者临床特征的比较

根据TACE术后疗效将87例PHC患者分为病情控制组（56例）和病情进展组（31例）。病情控制组中，男性33例，女性23例；年龄37～75岁，平均（58.31±9.24）岁；巴塞罗那肝癌临床（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期：B期38例，C期18例；Child-Pugh分级：A级49例，B级7例；肿瘤主要病灶直径5.25～10.43 cm，平均（8.94±2.61）cm。病情进展组中，男性22例，女性9例；年龄45～81岁，平均（65.47±8.68）岁；BCLC分期：B期19例，C期12例；Child-Pugh分级：A级23例，B级8例；肿瘤主要病灶直径5.52～11.81 cm，平均（8.56±3.29）cm。

2.2 TACE 治疗前后血清TSGF、miRNA-214水平的比较

TACE治疗前，病情控制组与病情进展组患者TSGF、miRNA-214表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。TACE治疗后，两组患者TSGF表达水平均下降，miRNA-214表达水平均升高，且病情控制组患者TSGF表达水平低于病情进展组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 TACE治疗前后两组患者血清TSGF、miRNA-214水平的比较（±s）

表1 TACE治疗前后两组患者血清TSGF、miRNA-214水平的比较（±s）

注：a与本组治疗前比较，P＜0.05；b与同时间病情进展组比较，P＜0.05

指标T S G F（U/m l）m i R N A-2 1 4治疗前治疗后治疗前治疗后1 8 9.2 1±1 5.1 4 1 3 4.2 6±1 0.2 6 a 0.5 6±0.1 8 1.1 4±0.2 9 a 1 7 1.5 7±1 3.5 8 9 4.2 6±1 1.3 7 a b 0.8 4±0.1 9 1.5 9±0.2 2 a时间病情进展组（n=3 1）病情控制组（n=5 6）

2.3 血清TSGF、miRNA-214表达水平预测TACE疗效的ROC曲线

ROC曲线结果显示，TSGF、miRNA-214表达水平预测TACE术后病情控制的AUC分别为0.849（95% CI=0.759～0.938）、0.807（95% CI=0.707～0.907），Cut-off值分别为181.32 U/ml、0.63。（图1）

2.4 血清TSGF、miRNA-214表达水平与患者生存情况的关系

图1 血清TSGF、miRNA-214水平预测TACE疗效的ROC曲线

87例患者3年内死亡43例，生存率为50.57%（44/87）。根据Cut-off值将87例PHC患者分为高TSGF组（43例）、低TSGF组（44例）和miRNA-214高表达组（47例）、miRNA-214低表达组（40例）。Kaplan-Meier曲线结果显示，低TSGF组患者的3年生存率为70.45%（31/44），高于高TSGF组的30.23%（13/43），差异有统计学意义（χ2=5.014，P=0.025）；miRNA-214高表达组患者的3年生存率为61.70%（29/47），明显高于miRNA-214低表达组的37.50%（15/40），差异有统计学意义（χ2=6.928，P=0.008）。（图2、图3）

图2 高TSGF组（n=43）及低TSGF组（n=44）患者的生存曲线

图3 miRNA-214高表达组（n=47）及miRNA-214低表达组（n=40）患者的生存曲线

3 讨论

随着TACE技术的不断成熟，其在临床普及迅速，有利于中晚期PHC患者的治疗，但由于单次介入治疗往往无法彻底消除病灶，因此介入治疗后的疗效评价成为了后续治疗的关键所在[10]。目前临床用于评价TACE术后疗效的主要方式是影像学检查和实验室检查，然而影像学检查存在一些缺陷，例如超声检查对于病灶较小的复发灶检出率较低，计算机断层扫描（CT）检查容易混淆碘油沉积和强化的肿瘤病灶，不利于残留病灶的判断，磁共振成像（MRI）虽然检出率高，但由于其检查费用偏高，故而使用较受限[11]。实验室检查使用最多的是甲胎蛋白，但由于存在甲胎蛋白阴性肝癌，其对TACE术后疗效的预测价值存在较多的争议[12]。因此寻找方便、快捷的血液肿瘤标志物用于预测和评估患者的预后情况是目前肝癌研究的重点所在。

TSGF是恶性肿瘤生长及扩散过程中生成的一类生长因子，有利于促进肿瘤及周围组织毛细血管生成及增殖，同时还会释放上皮生长因子及干细胞生长因子等至血液中，因此血清中的TSGF水平对于肿瘤的诊断和预后有非常高的应用价值[13]。本研究结果发现，TACE治疗后病情进展患者的TSGF水平高于病情控制患者，且治疗后TSGF水平也降低，表明血清TSGF水平在评价TACE术后疗效上具有一定的价值。马颖等[14]研究发现，PHC患者TACE术后TSGF水平显著降低，与本研究结果一致。既往研究认为，miRNA会被细胞外存在的RNA酶降解，但后来研究证明miRNA可以广泛而稳定地存在于细胞外液中，因此检测外周血中的miRNA表达情况在恶性肿瘤的诊断和防治中得到了广泛研究[15]。有研究表明，miRNA-214在不同来源肿瘤组织中的表达存在差异，例如其在胃癌、胰腺癌中表达显著上调，在肝细胞肝癌中显著下调[16]。本研究结果发现，TACE治疗后病情进展患者miRNA-214表达水平低于病情控制患者，术后miRNA-214水平也增高，表明血清miRNA-214表达水平在评价TACE术后疗效上具有一定的价值。陈琳等[17]研究发现，胃癌患者外周血中miRNA-214表达水平显著升高，并且miRNA-214高表达患者的预后不佳，与本研究结果相反，可能与miRNA-214的组织特异性表达相关。

本研究利用ROC曲线评估了TSGF、miRNA-214表达水平预测TACE疗效的价值，发现TSGF、miRNA-214表达水平预测TACE疗效的AUC值均超过了0.800，表明TSGF、miRNA-214表达水平均具有较高的预测价值，且TSGF水平为181.32 U/ml、miRNA-214表达水平为0.63的时候，约登指数最大。根据Cut-off值将患者分为高TSGF组、低TSGF组和miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组，Kaplan-Meier曲线结果显示低TSGF组的3年生存率高于高TSGF组，miRNA-214高表达组的3年生存率高于miRNA-214低表达组。表明血清中TSGF、miRNA-214表达水平与患者的远期预后关系密切。

综上所述，TACE作为中晚期肝癌患者的主要治疗手段，方便、快捷地评价TACE疗效的指标对其后续治疗具有积极意义，本研究结果显示血清TSGF、miRNA-214表达水平均具有较高的预测TACE疗效的价值，并且与患者远期预后关系也较为密切，值得临床推广。