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(1.哈尔滨工业大学化工与化学工程学院,黑龙江哈尔滨 150090;2.内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司研发中心,内蒙古呼和浩特 011500)

嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)是全球公认安全的食品级微生物,被欧洲食品安全局(European food safety authority,EFSA)认定具有安全资格(Qualified presumption of safety,QPS)[1-2]。嗜热链球菌是最常见的酸奶发酵剂之一,它在酸奶发酵前期产酸、产多糖等方面都发挥着重要的作用,在乳制品生产中,常与保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)混合发酵生产以提高发酵乳品的风味及乳品品质[3-6],被认为是仅次于乳酸乳球菌第二重要的工业化乳酸菌[7]。

嗜热链球菌优良的发酵性能使其作为发酵剂已经在乳制品行业中得到广泛的推广和应用。但研究资料显示,某些嗜热链球菌也表现出一定的益生特性,对宿主有着极为重要的生理功能[8],其产生的胞外多糖具有降胆固醇、改善人体肠道菌群平衡、提高机体免疫力以及抗肿瘤等益生特性[9-11]。

本研究所采用的嗜热链球菌MN-ZLW-002,是一株分离自甘南地区传统发酵乳品中高产胞外多糖的菌株,该菌生长速度快,发酵风味突出,后酸化弱,且具有良好的贮藏稳定性[12],是一株具有优良发酵性能的菌株。本文以模拟胃液和胆盐中菌株耐受性能、胆固醇降解能力和安全性(抗生素、急性经口毒性)对MN-ZLW-002进行分析,旨在深入挖掘菌株MN-ZLW-002的益生特性和安全性,为开发益生菌发酵食品级功能原料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌种:MN-ZLW-001、MN-ZLW-002、MN-ZLW-005Streptococcusthermophiles,哈尔滨工业大学化工与化学工程学院;MN-ZLW-003Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus哈尔滨工业大学化工与化学工程学院;BB12Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis,科汉森(北京)贸易有限公司;实验动物:清洁级昆明种小鼠20只,体重19～20 g 华阜康生物科技股份有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2009-0007;饲料 军事医学科学院实验动物中心;胆固醇、胆盐、胃蛋白酶、氯霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素、卡那霉素、青霉素、红霉素、克林霉素 分析纯,Sigma公司(美国);MRS液体培养基、MRS琼脂培养基 北京陆桥;灭菌生理盐水、抗生素 生工生物工程(上海)股份有限公司。

2000237电热恒温培养箱 西班牙J.P.SELECTA公司;G560E漩涡混合器 美国SCIENTIFIC Instruments公司;PB-10 pH计 北京赛多利斯仪器系统有限公司;CP21GⅡ高速冷冻离心机 日立公司;ML51生物显微镜 日本Olympus公司;SVE-6A1超净工作台 新加坡ESCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的活化 将供试菌株的甘油菌液以2%接菌量接入5 mL灭菌MRS液体培养基中(115 ℃,15 min),与厌氧条件下培养18 h进行活化,按此方法继续活化2代,取活化第3代的菌株进行试验。

1.2.2 菌株活菌计数 将活化好的菌液进行100倍稀释,用细胞计数板进行菌株的计数,根据计数结果,调整供试菌株接菌浓度为1×108CFU/mL。

1.2.3 菌株人工胃液耐受性及胆盐耐受性试验 将活化的菌株接入5 mL pH2.0、pH3.0人工胃液及胆盐MRS培养基中(接菌浓度为1×108CFU/mL),将接菌的培养基于37 ℃厌氧条件下培养4 h,分别于培养0 及4 h取样,进行倍比稀释,选择适当的稀释梯度进行活菌计数,并计算4 h存活率。

其中,pH2.0人工胃液:NaCl 0.2%,胃蛋白酶0.35%,蒸馏水溶解后,用1 mol/L HCl调整pH至2.0,过滤除菌;pH3.0人工胃液:NaCl 0.2%,胃蛋白酶0.35%,蒸馏水溶解后,用1 mol/L HCl调整pH至3.0,过滤除菌;胆盐MRS培养基:于MRS液体培养基中加入胆盐,使终浓度为0.3%,115 ℃灭菌15 min。

1.2.4 菌株胆固醇降解能力试验 采用邻苯二甲醛法进行实验分析[13]。

参照文献[13-14]的方法测定胆固醇含量。略作改动,具体操作如下:MN-ZLW-002以2%接种量接入液体MRS-胆固醇培养基(于MRS液体培养基中加入胆盐及10 g/L胆固醇溶液,使胆盐终浓度为0.3%,胆固醇终浓度为100 μg/mL,115 ℃灭菌15 min),在37 ℃条件下,厌氧培养18 h,以不接菌的MRS-胆固醇培养基作为对照样。4 ℃条件下,12000×g,离心10 min,取上清液用于检测降胆固醇能力。用手动移液器分别吸取1 mL上清液,加入18 mm×180 mm的干净试管。加入2 mL 95%乙醇,用快速混匀器调至6档漩涡混匀20 s。再加入2 mL 50% KOH溶液,用快速混匀器调至6档漩涡混匀20 s。塞上试管塞后,60 ℃条件下水浴15 min。冷却后,加入5 mL正己烷,用快速混匀器调至6档漩涡混匀20 s。再加入3 mL蒸馏水,用快速混匀器调至6档漩涡混匀20 s。塞上试管塞后,室温下,放置15 min,使两相充分分层。用手动移液器吸取1 mL正己烷层溶液,加入15 mm×100 mm的干净试管,60℃条件下烘干。加入2 mL邻苯二甲醛溶液,用快速混匀器调至6档漩涡混匀20 s,塞上试管塞后,室温下放置10 min。而后用1 mL移液管吸取1 mL浓硫酸,沿试管内壁小心加入其中,立即用快速混匀器调至6档漩涡混匀20 s,塞上试管塞后,室温下放置10 min。以NCFM为参照菌株,相同条件下测定梯度浓度含量的胆固醇溶液的吸光值,绘制胆固醇标准曲线。根据胆固醇标准曲线计算胆固醇的含量。以未接菌的培养基作为空白对照,菌株的胆固醇降解率计算公式为:

胆固醇降解率(%)=(C-A)/C×100

式中:A为发酵上清液的胆固醇含量/μg;C为空白对照的胆固醇含量/μg。

1.2.5 菌株MN-ZLW-002的安全性实验

1.2.5.1 抗药性的检测 采用液体最小抑制浓度(MIC)法对菌株MN-ZLW-002的抗药性进行检测。将过夜活化的菌株稀释后接种到含有不同浓度抗生素的ISL-lactose[15]培养基中,使培养基中菌株的终浓度为105CFU/mL,然后将其置于37 ℃培养48 h,观察菌株的生长情况。最小抑制浓度定义为能抑制菌株生长的最低抗生素浓度。

1.2.5.2 急性经口毒性试验 a.受试物配制方法:称取15 g MN-ZLW-002菌株受试物,加去离子水至40 mL,混匀使用。b.急性经口毒性试验:按“一次最大限度试验”要求,选健康成年小鼠20只,体重19～22 g,雌、雄各半,剂量设计雌性为15 g/kg BW,雄性为15 g/kg BW,按0.2 mL/10 g BW×2次/24 h经口灌胃给予受试物。灌胃前动物隔夜禁食,自由饮水。灌胃后连续观察4 h,给予正常饮食。以后每天观察至第14 d,记录中毒体征及死亡情况,并计算半数致死量LD50。

logLD50=∑1/2(Xi+Xi+1)·(Pi+1-Pi)

式中:Xi与Xi+1及Pi+1及Pi分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。

c.结果判定:按食品安全毒理学评价程序和方法(GB 15193-2003)中“急性毒性(LD50)剂量分级表”进行判定:LD50>15000 mg/kg可判定无毒,5001 mg/kg

1.3 数据分析

本研究中各试验均重复3次,采用Microsoft Excel进行数据整理和各曲线的绘制;数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析,结果以均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 菌株对模拟胃液和胆盐的耐受性

将菌株接种到不同pH的人工胃液中培养,测定其对酸度的耐受性,结果如图1所示。

图1 在pH2.0人工胃液中的存活率Fig.1 Survival rate in artificial gastric juice at pH2.0注:不同小写字母表示差异显著,P<0.05;图2、图3,图5同。

由图1可见,在pH2.0人工胃液培养4 h后,MN-ZLW-002的存活率为79.68%±6.04%,显著高于MN-ZLW-001、MN-ZLW-003及MN-ZLW-005(P<0.05)。分析可能与MN-ZLW-002高产胞外多糖有关,MN-ZLW-002在生长代谢过程中产生的大量胞外多糖依附于菌体细胞壁形成荚膜,荚膜多糖的凝胶、乳化及持水作用使菌体能够能好地适应酸性环境[15]。参考菌株BB12存活率为111.74%±8.93%,高于MN-ZLW-002,但差异不显著(P>0.05)。

图2 在pH3.0人工胃液中的存活率Fig.2 Survival rate in artificial gastric juice at pH3.0

在pH3.0人工胃液培养4 h后,MN-ZLW-002的存活率最高,为120.24%±6.88%,显著高于MN-ZLW-001、MN-ZLW-003及MN-ZLW-005(P<0.05),略高于BB12(存活率为106.09%±4.23%)。

由图3可见,0.3%胆盐MRS培养4 h后,MN-ZLW-002存活率较低,为5.47%±0.70%,显著低于其它株菌(P<0.05)。

图3 菌株在0.3%胆盐中的存活率Fig.3 Survival rate of tested strains in 0.3% bile salt

耐受性试验结果显示,嗜热链球菌MN-ZLW-002对pH2.0及pH3.0环境耐受性较好,但对0.3%胆盐的耐受性较弱。

2.2 胆固醇降解效果测定

2.2.1 胆固醇标准曲线的绘制 以胆固醇质量浓度为横坐标,吸光度OD550 nm为纵坐标绘制标准曲线(图4),标曲公式为y=2.0107x+0.1468,R2=0.9976,线性关系良好,可用于胆固醇降解能力的测定。

图4 胆固醇标准曲线Fig.4 The standard curve of cholesterol

2.2.2 胆固醇降解能力测定 由图5可见,动物双歧杆菌BB12对胆固醇的降解率最高,为81.81%±3%,显著高于其余4株自有菌株(P<0.05);自有菌株中,MN-ZLW-002对胆固醇的降解率最高,为42.66%±2.11%,但差异不显著(P>0.05)。

图5 菌株对胆固醇的降解率Fig.5 The degradation rate of cholesterol of tested strains

表1 MN-ZLW-002对抗生素的MIC检测结果Table 1 MIC results of strain MN-ZLW-002

表2 MN-ZLW-002急性毒性观察情况Table 2 The acute toxicity of MN-ZLW-002

2.3 MN-ZLW-002对抗生素的敏感性(MIC)

MN-ZLW-002具有高产胞外多糖的特性,同时体外益生功能评价试验结果显示,四株自有菌株中,MN-ZLW-002具有更好的酸耐受性和胆固醇降解能力,具有作为益生菌开发的潜质。因此,试验选择MN-ZLW-002进行下一步的安全性评价。

利用MIC方法检测MN-ZLW-002对抗生素的敏感性,结果如表1所示。根据EFSA(European Food Safety Authority)的cut-off值可判断,MN-ZLW-002对氯霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素、卡那霉素、青霉素、红霉素和克林霉素均敏感。

2.4 小鼠经口毒性实验

在14 d的观察期内,实验动物生长正常,未见明显中毒体征,无死亡,大体解剖未见异常，急性毒性观察结果见表2。受试物MN-ZLW-002对小鼠急性经口半数致死量为:雌性LD50大于15 g/kg BW,雄性LD50大于15 g/kg BW。根据食品安全毒理学评价程序和方法(GB 15193-2003)中急性毒性分级标准判定,MN-ZLW-002急性经口毒性属无毒。

3 结论与讨论

MN-ZLW-002是从甘南藏族自治州传统发酵乳制品中筛选获得的一株高产胞外多糖的嗜热链球菌,本文对该菌的体外益生功能及安全性能进行了研究。结果显示,MN-ZLW-002对pH2.0及pH3.0的人工胃液耐受性较好,与对照菌株BB12无显著差异(P>0.05),但显著强于其它三株自有菌株(P<0.05)。MN-ZLW-002对0.3%胆盐耐受性较弱,驯化是提高菌株耐受性能有效的方法[16-20],后续会对MN-ZLW-002进行驯化,以提高其胆盐耐受力。

目前报道中,各菌株的体外胆固醇降解率各异。Dilmi-Bouras[21]报道的来源于酸奶的几株嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌也具有降低培养基中总胆固醇的能力。刘丽莉等[22]报道了来源于发酵果蔬食品中的6 种乳酸菌的体外胆固醇降解率在18.5%～28%之间不等。林斌等[23]从自然发酵的酸乳中分离得到一株植物乳杆菌HLX37,在培养24 h后,其胆固醇降解率可达37.33%±2.55%。相比之下,MN-ZLW-002体外降胆固醇能力高于植物乳杆菌HLX37,但弱于BB12,后续将采用驯化、诱变等手段,以提高MN-ZLW-002降解胆固醇能力。

综上,MN-ZLW-002具有良好的模拟胃液耐受性、较强的胆固醇降解能力,且安全无毒,可作为功能型发酵食品原料进行开发,具有巨大的商业价值和市场应用前景。