郑泉兴 张建平 李巧灵 刘秀彩 黄朝章 蓝洪桥许寒春 于德德 刘 雯 叶仲力 刘江生 伊晓东 李 斌 谢 卫，* 邓 楠，*

（1.福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建厦门，361021；2.厦门大学化学系，福建厦门，361005；3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南郑州，450001）

植物纤维是地球上储量丰富的可再生资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素3 种高分子聚合物组成[1-3]。其中，纤维素是由β-1,4-糖苷键连接成的脱水葡萄糖组成的线性聚合物，而半纤维素比纤维素复杂得多，是由戊糖（木糖和阿拉伯糖）、己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和己糖酸（4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸）等单元组成的具有一些分支的杂多糖，这些官能团可以组装成各种半纤维素多糖，具有从线性到高度分支的不同结构，如β-1,4-D-聚木糖、阿拉伯糖基聚木糖、聚甘露糖、聚葡萄糖、聚半乳糖、半乳糖葡萄糖聚甘露糖等，而这些半纤维素多糖的详细糖组成和化学结构因植物的种类而异[1,4]，如阔叶木半纤维素的主链主要由通过β-1,4-糖苷键连接的木糖单元组成，针叶木半纤维素主要由半乳糖-葡萄糖-聚甘露糖以及阿拉伯糖-葡萄糖醛酸-聚木糖组成[4]。而木质素是由苯丙烷衍生物单体（如香豆醇、松柏醇和芥子醇）构成的一种具有高度支链的芳香族高分子化合物，其结构复杂、分子质量大[1]。

由于纤维素、半纤维素和木质素之间存在复杂的连接关系，完全分离这3种组分仍然是一项具有挑战性的任务。目前，造纸行业通常采用“硝酸-乙醇法”来测定纤维素含量， 采用12% 盐酸水解法（GB/T 2677.9－1994）来测定半纤维素或聚戊糖含量，采用72%硫酸法（GB/T 2677.8－1994）和紫外分光光度法（GB/T 10337－1989）来分别测定酸不溶木质素和酸溶木质素的含量[1,5-6]。然而这些方法的缺点是操作繁琐，并且不能有效地区别半纤维素的结构组成。美国国家可再生能源实验室（NREL）开发了采用两阶段酸水解进行系统分析纤维中3大组分含量的方法[7]，该方法先在低温下使用高浓度硫酸将纤维转化为低聚糖，然后在高温下使用稀酸将低聚糖进一步转化为单糖，通过高效液相色谱对单糖进行分析来确定纤维素和半纤维素的含量，并且通过称量滤渣质量以及对酸水解液采用UV 检测来分别确定酸不溶木质素和酸溶木质素的含量，该方法操作简便，被国际上各研究机构广泛采用[7-8]。

目前，针对糖的检测主要有气相色谱法[9]、液相色谱法[10]等，但气相色谱法需将糖转化为挥发性的衍生物才能分析，而液相色谱法多采用灵敏度较低的示差折光检测器（如NREL 所采用方法），这两种方法都增加了单糖分析的复杂性和难度。而高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法是近年来新发展起来的一种用于糖分析的方法，该方法在强碱性介质中，用高效阴离子交换柱分离糖类，然后对糖分子结构中的羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电流实现检测[11-12]，该方法前处理简单，而且采用灵敏度高、选择性高的脉冲安培检测器，具有较高准确度和重现性等优点受到科研工作者的广泛关注。柴银等人[11]采用离子色谱法测定牛蒡多糖的单糖组成；乐胜锋等人[12]利用离子色谱法测定了芦荟多糖中的7 种单糖含量；Chai 等人[13]采用离子色谱法测定了三倍体杨纤维的单糖组成。

本研究采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法建立了单糖的检测方法，对纸浆纤维的单糖组成差异进行定性与定量分析，为造纸用纤维组成的解析提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

针叶木纤维（瑞典森林浆，云杉）、阔叶木纤维（巴西金鱼阔叶木浆，桉木）、亚麻纤维（西班牙赛利莎亚麻浆），杭州华丰纸业有限公司；竹纤维，重庆理文造纸有限公司；棉纤维、草浆纤维（龙须草），福建金闽再造烟叶发展有限公司。

采用的糖标准品包括：L-(+)-阿拉伯糖（99%,Macklin 公司）、D-半乳糖（99%，Macklin 公司）、葡萄糖（一水，分析纯，国药集团）、D-(+)-木糖（≥99%, Macklin）、D-甘露糖 （99%，Macklin）、D-(+)-半乳糖醛酸（一水，97%～101%，上海沃凯化学试剂有限公司）、D-葡萄糖醛酸（98%, Macklin 公司）以及D-纤维二糖（98%, Macklin 公司）。其他试剂：无水醋酸钠（≥99%，美国ACROS ORGANICS）、NaOH溶液（50%，Fluka），实验用水均经过0.22 μm 滤膜过滤过的二次蒸馏水（Milli-Q纯水）。

仪器： ICS-3000 离子色谱仪（配有ASRS-300 4 mm 型抑制器、直流安培检测器和电导检测器）、Carbo PAC PA 10 色谱柱（2.0 mm×250 mm，带PA 10保护柱2 mm×50 mm，美国戴安公司）；0.45 μm聚醚砜微孔滤膜（美国Agilent 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；BSA2245-CW 电子天平（感量：0.0001 g，德国赛多利斯公司）。

1.2 标准溶液的配制

准确称取标准糖样品（阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和纤维二糖）各50 mg（精确至0.1 mg）分别溶于蒸馏水中，然后转移至50 mL容量瓶内定容，配制成1000 mg/L的标准糖储备液。用移液管分别移取各标准糖储备液10 mL 于100 mL 容量瓶中，超纯水定容后配制成100 mg/L 的混合标准溶液，逐级稀释成浓度0.01、0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 0.8、 1.0、 2.0、 4.0 和5.0 μg/mL的标准溶液备用。

1.3 样品处理

按照参考文献[7]中NREL 两步酸解法的步骤进行。称取干燥后的纤维样品0.3 g（记纤维干质量m0），加入3 mL质量分数72%硫酸，摇匀，于30℃水浴中加热1 h，然后加入84 mL 水，溶液转移至耐压玻璃管里，置于灭菌锅中，121℃下酸解1 h。所得的酸解溶液样品采用砂芯漏斗过滤后，取一部分稀释100 倍，用离子色谱来测定单糖和纤维二糖含量。每个纸浆纤维样品酸解做二次平行实验，离子色谱检测除特别说明外，均重复两次，取平均值。由于单糖在酸性条件会进一步水解成糠醛、5-羟甲基糠醛等造成单糖的损失，因此按照NREL 方法，每种纸浆纤维样品均需要配制与之单糖组成比例相近的单糖回收标样，并在同样的条件下进行酸解反应，做二次平行实验，计算单糖平均回收系数，用来校正纤维单糖含量。计算公式如式(1)和式(2)所示[8]。

单糖平均回收系数：

单糖含量：

式中，下标i 代表各糖；Ri为单糖的平均回收系数；Ci,ICS为单糖回收标样酸处理后从离子色谱得到的浓度，μg/mL；Ci,known为单糖回收标样酸处理前的浓度，μg/mL；Si为纤维的单糖含量，%；Ci为各单糖从离子色谱得到的浓度，μg/mL；n为稀释倍数；V为溶液总容积，mL；m0为纤维绝干质量，mg；f为各单糖的校正系数，其中五碳糖（木糖和阿拉伯糖）的校正系数为0.88（132/150，150 是五碳糖的相对分子质量，132 是纤维上五碳糖基的相对分子质量），六碳糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）的校正系数为0.90（162/180，180 是六碳糖的相对分子质量，162是纤维上六碳糖基的相对分子质量）。

1.4 色谱条件

色谱柱：Carbo PAC PA 10 （2.0 mm×250 mm，带PA 10 保护柱2 mm×50 mm）；检测模式：积分脉冲安培检测；工作电极：Au 电极；参比电极：AgCl/Ag；扫描电位采用戴安公司推荐的脉冲点位波形，见表1；流动相：A为超纯水，B为高浓度NaOH溶液（200 mmol/L），C 为醋酸钠溶液（1.0 mol/L），D 为低浓度NaOH 溶液（10 mmol/L）；流速0.25 mL/min；温度20℃；进样量25 μL。流动相梯度洗脱程序见表2，主要分为 3 个阶段：0～30 min 为低浓度 NaOH 洗脱阶段，主要用来分离单糖；30～65 min 为高浓度NaOH洗脱阶段，主要用来分离未完全解离的二糖；65～80 min为醋酸钠和NaOH共同洗脱阶段，主要用来分离糖醛酸样品；80～95 min 为分离后高浓度NaOH冲洗柱子阶段。

表1 分离糖的检测波形

表2 高效阴离子色谱梯度洗脱程序 %*

2 结果与讨论

2.1 离子色谱条件的优化

由于中性单糖的解离常数（pKa 值）在12 左右（见表3），实际上是弱酸，在高pH 值条件下，它们能部分电离为阴离子并在阴离子交换柱上保留并分离。由于甘露糖和木糖、半乳糖和阿拉伯糖的pKa值很接近，因此考察了不同NaOH 洗脱液浓度对这几个单糖的分离度以及峰形的影响，结果见图1。从图1可以看出，当NaOH 浓度为20 mmol/L 时，除了阿拉伯糖，其他几个单糖几乎重叠在一起，分离度很差；当NaOH 浓度为10 mmol/L 时，阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖可以完全分离，但是峰形较差，而木糖和甘露糖重叠成一个峰；当NaOH 浓度从5 mmol/L 降低至3 mmol/L时，各单糖的保留时间逐渐增加，且木糖和甘露糖的分离度逐渐提高；当NaOH 浓度为2 mmol/L时，5 种单糖峰形对称，并且达到了完全分离，且保留时间随pKa值的增大而减小。因此，在后续的实验中，最终采用浓度为2 mmol/L 的NaOH 洗脱液来分离单糖。

表3 单糖25℃下的pKa值[14]

图1 洗脱液中NaOH浓度对单糖分离的影响

2.2 方法验证

2.2.1 线性关系考察

分别配置了浓度为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 和 5.0 μg/mL 的各糖标准品混合溶液，在相同条件下分别进样后，所得的谱图以及各单糖的定性结果见图2。以糖浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得到相应的线性方程以及相关系数，并且根据三倍信噪比（S/N=3）计算仪器检出限。其线性关系和检出限见表4。由表4 可知，各种糖在浓度0.01～1.0 μg/mL 范围内具有非常好的线性关系，相关系数R2最小值为0.9988。单糖的检出限最小为阿拉伯糖和甘露糖（0.0022 mg/L），最大为葡萄糖（0.0046 mg/L）。

图2 单糖混标溶液的离子色谱图

表4 单糖标品的线性关系、相关系数和检测限

2.2.2 重复性考察

以一定浓度糖（各个糖实际浓度见表5）的混合标准品为样品，连续进样7次进行重复性实验，其结果见表5。由表5 可以看到，保留时间的相对标准偏差值（RSD）最大为0.12%（葡萄糖），最小值为0.03%（葡萄糖醛酸），峰面积的RSD 值最大为甘露糖1.83%，最小为纤维二糖0.63%，表明该方法的重现性非常好。

2.2.3 加标实验

采用对针叶木纤维分别添加3 种不同量的标准品糖（每个实验重复3 次），以分析其回收率，结果见表6。从表6 可以看到，糖的回收率良好，平均回收率在96.62%～102.42%，进一步验证该方法的准确度良好。

表5 单糖的保留时间和峰面积的重复性实验

2.3 纸浆纤维的单糖组成

表7 列出了几种纸浆纤维的单糖组成。由表7 结果可知，各纤维的单糖组成中含量最多的均为葡萄糖，其来源主要是纤维中的纤维素[1,15]。其中，葡萄糖含量最高的为棉纤维，由于棉纤维的纤维素含量达到95%以上（葡萄糖基以β-1,4-糖苷键连接）[1]，这与实验得到的平均葡萄糖含量95.84%相吻合；亚麻纤维的葡萄糖含量达到92.19%，文献报道亚麻原料的纤维素含量为65%～80%[16]，由于造纸的亚麻浆板经过漂白和脱木素处理，从而导致纤维素的含量增加。其他纤维原料纸浆中的葡萄糖平均含量相差不大，顺序依次为：阔叶木纤维（75.80%）＞针叶木纤维（74.56%）＞竹纤维（74.05%）＞草纤维（71.90%）。

除了葡萄糖，构成纸浆纤维的单体组分还含有木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖，且不同纸浆纤维间存在较大的差异，这是由于这些单糖来源于半纤维素的水解，而半纤维素的化学结构因植物的种类而异[1,4]。由表7可知，针叶木纤维含有7.60%木糖和4.65%甘露糖，以及少量的阿拉伯糖（0.71%） 和半乳糖（0.29%），其中，甘露糖含量在6 种纤维中最高，这是由于针叶木纤维的半纤维素主要由半乳糖-葡萄糖-聚甘露糖组成，其主链由β-1,4-葡萄糖和甘露糖残基聚合而成，α-1,6-半乳糖为其主要侧枝；另外，针叶木纤维还有一部分半纤维素由阿拉伯糖-葡萄糖醛酸-聚木糖组成，其主链由聚木糖（吡喃木糖基通过β-1,4-糖苷键链接）构成，葡萄糖醛酸作为侧基连接到木糖基的O-2 位，阿拉伯糖基连接到木糖基的O-2 或者O-3 位[4]。阔叶木纤维的木糖（15.02%）含量高于针叶木纤维， 而阿拉伯糖 （0.01%） 和半乳糖（0.04%）显著低于针叶木纤维，这是由于阔叶木纤维的半纤维素主要以聚木糖为主链，以半乳糖和葡萄糖醛酸为侧基构成[4]。竹纤维和龙须草纤维中含有较高的木糖和阿拉伯糖含量，其木糖含量分别为17.27%和17.19%，这是由于竹纤维和龙须草纤维的半纤维素主要是以聚木糖为主链，阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基分别连接到木糖基的O-2 和O-3 位构成的多糖[17-18]。亚麻纤维的木糖和甘露糖含量分别为4.17%和0.09%，这是由于半纤维素主要由乙酰化的线性聚木糖和葡萄糖-聚甘露糖构成[16]。棉纤维含有0.214%木糖，主要来源于半纤维素里的木糖聚葡萄糖，该多糖是由β-1,4-聚葡萄糖骨架为主链，部分葡萄糖残基的O-6 连接木糖构成的[19]。表7 的纤维单糖组成与文献报道的不一致，这是由于本研究采用的纸浆纤维原料都经过脱木素处理，在脱木素的同时半纤维素也会发生酸性水解或碱性水解而损失[20]，其含量受原料化学制浆工艺条件决定。另外，纤维酸水解溶液中纤维二糖的含量均小于0.02%，说明纤维水解反应比较彻底。

表6 针叶木纤维加标平均回收率

表7 不同纸浆原料的单糖组成 %

3 结 论

本研究建立了离子色谱-脉冲安培法检测纸浆纤维水解常见的单糖（阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖）、糖醛酸（半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）和纤维二糖的测定方法。

3.1 采用积分脉冲安倍为检测器，以氢氧化钠和醋酸钠为洗脱液，在Carbo PAC PA 10 （2.0 mm×250 mm）色谱柱上进行梯度洗脱时，分离得到8种糖组分，在浓度0.01～1.0 μg/mL 范围内，相关系数R2＞0.9988，检出限在0.0022～0.0046 mg/L 之间，峰面积的相对标准偏差值（RSD）为0.63%～1.83%，平均回收率为96.62%～102.42%，满足分析检测要求。

3.2 采用该方法分析不同纸浆纤维的水解单糖组成，发现针叶木纤维（云杉）、阔叶木纤维（桉木）、竹纤维、亚麻纤维、龙须草纤维和棉纤维具有较大的差异。针叶木纤维由葡萄糖、木糖、甘露糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖组成；阔叶木纤维由葡萄糖和木糖以及微量的阿拉伯糖和半乳糖组成；竹纤维由葡萄糖、木糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖组成；亚麻纤维由葡萄糖和木糖以及微量的阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成；龙须草纤维由葡萄糖和木糖以及微量的阿拉伯糖和半乳糖组成；棉纤维主要由葡萄糖组成。