王飞兵 李 威 张 扬 党长喜 叶玉秀 张 凡 陈新红 周 青

(1淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003；2江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)

土地盐碱化是导致农作物减产的主要原因之一，严重制约着现代农业的高效发展[1-2]。 在耕地有限、人口不断增长的时代，如何开发和使用盐渍土壤发展农业，提高农作物产量已经成为生物技术迫切需要解决的主要问题之一，也是我国农业生产需要解决的重要问题[3]。

马铃薯(Solanum tuberosumL.)是我国继小麦、水稻、玉米之后的第四大粮食作物，是世界上重要的粮食、菜用作物，也是重要的工业原料植物[4]。 研究发现，马铃薯属盐中度敏感植物，土壤高盐胁迫已严重影响马铃薯产量，不利于其产业高效健康发展。 因此，研究马铃薯响应高盐胁迫分子机制，以及开展马铃薯响应盐胁迫相关基因的克隆与功能研究具有重要意义。

蔗糖非发酵-1-型相关蛋白激酶-1(SnRK1)在植物体内参与调节重要的生理活动，在植物碳水化合物的代谢、发育及逆境胁迫响应等多种生理过程中扮演着重要角色[5-8]。 研究表明，SnRK1 通过调控ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)和蔗糖合酶( sucrose synthase，SUS)活性，参与植物体内淀粉合成调控，进而参与植物的生长代谢[5，7-11]。 但关于SnRK1 在植物逆境胁迫方面研究报道较少。 桃PpSnRK1βγ1 基因过表达显著提高拟南芥的萌芽率和抗氧化能力[12-13]。 张淑辉等[14]研究发现过表达桃PpSnRK1α基因可提高番茄植株耐盐性；Wang 等[7]研究发现，从马铃薯中克隆得到StSnRK1 基因，过表达该基因可显著上调烟草植株的淀粉合成途径关键酶基因表达，增加相应酶活性，从而显著提高淀粉含量，调控烟草植株的碳水化合物代谢。 但有关马铃薯StSnRK1 在抗盐胁迫方面的研究鲜见报道。

前期研究获得了过表达马铃薯StSnRK1 基因的转基因烟草植株[7]。 本研究以过表达株系和野生型烟草植株为材料，在盐胁迫条件下，研究过表达马铃薯StSnRK1 基因提高烟草植株耐盐性的分子及生理机制，以期为耐盐马铃薯的分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室2017年培育的过表达马铃薯StSnRK1 的烟草W38(Nicotiana tabacumvar. Winsconsin 38)转基因植株[7]。 将转基因植株和野生型植株于25℃组培室中培养，用于鉴定目的基因StSnRK1 响应盐胁迫的功能研究。

1.2 转基因植株耐盐性鉴定

根据陈新红等[4]和Jiang 等[15]的方法，选用200 mmol·L-1NaCl 用于转基因烟草的耐盐性鉴定。将过表达转基因烟草株系和野生型(WT)植株分别继代于含有0 mmol·L-1NaCl 的正常条件和200 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 培养基上胁迫培养，培养条件为25±1℃，光照强度3 000 Lux，光照时间13 h，4 周后观察并记录植株生长情况及表型变化，测量植物的鲜重、根数和根长，鉴定其耐盐性。 每个处理均设3 次生物学重复。

1.3 转基因植株逆境胁迫相关基因表达分析

以正常条件培养4 周和盐胁迫处理4 周的转基因烟草株系叶片和WT 植株叶片为试验材料，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)技术分析逆境胁迫相关基因的表达情况，参照RealMasterMix(SYBR Green)[天根生化科技(北京)有限公司]试剂盒方法进行。 胁迫相关基因引物序列如下:NtP5CS-F: 5′-CTGATGGA AGATTAGCACTTGG-3′和NtP5CS-R:5′-CTCCTACAG CACCTGAAGTC-3′；NtLEA5-F:5′-TTGAATCTGGGGT TTTGGTT-3′和NtLEA5-R:5′-GGAAGCATTGACGAGC TAGG-3′；NtSOD-F:5′-CTCCTACCGTCGCCAAAT-3′和NtSOD-R:5′-GCCCAACCAAGAGAACCC-3′；NtPOD-F:5′-CTTGGAACACGACGTTCCTT-3′和NtPOD-R:5′-TC GCTATCGCCATTCTTTCT-3′。 内标基因选用烟草NtActin基因，NtActin-F:5′-AGCAGCATGAAGATTAAG GTTGTAGCAC-3′和NtActin-R:5′-TGGAAAATTAGAA GCACTTCCTGTGAAC-3′。 每个样品均作4 个平行管。 PCR 热循环仪为ABI7500(ABI，美国)，操作软件为7500 software V2.0.1，荧光染料为SYBR Green PCR Master Mix[天根生化科技(北京)有限公司]。采用2-ΔΔCT法[16]计算基因的相对表达量。 每个处理设3 次生物学重复。

1.4 转基因植株相关抗性物质含量的测定

正常条件培养和盐胁迫处理4 周后，分别取0.50 g 转基因烟草株系叶片和WT 植株叶片测定其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶( peroxidase，POD ) 活性，脯氨酸、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 和过氧化氢(H2O2) 含量。SOD 和POD 活性的测定均采用李合生等[17]的方法。脯氨酸、MDA 和H2O2含量测定按照Wang 等[18]的方法。 每个处理设3 次生物学重复。

1.5 数据分析

原始数据的处理采用Microsoft Office 2010 Excel软件，统计分析采用SPSS17.0 软件进行方差分析和显著性检验。P＜0.05 或P＜0.01 被认为在统计学上有显著或极显著差异。

2 结果与分析

2.1 过表达StSnRK1 转基因烟草植株耐盐性鉴定

将之前研究报道获得的不同转基因烟草植株(＃2、 ＃3 和＃4)[7]分别培养在含0 mmol·L-1NaCl 正常条件和200 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 培养基上，4 周后观察转基因植株和WT 植株的生长状态。 正常条件下，＃2、＃3 和＃4 转基因植株的生长状态、鲜重、根数和根长与WT 相比无显著差异(图1-A1 ～A4)；200 mmol·L-1NaCl 处理后，＃2、＃3 和＃4 转基因植株的鲜重、根数和根长均显著或极显著优于WT 植株，分别较WT 提高了124% ～213%、222% ～368%和303% ～466%(图1-B1～B4)。 此外，在200 mmol·L-1NaCl 处理下，WT 植株长势较差，生根困难；转基因植株的生长状态和生根情况均优于WT 植株；通过耐盐离体鉴定结果表明，过表达StSnRK1 转基因烟草植株的耐盐性明显优于WT 植株。

2.2 盐胁迫下转基因烟草植株相关基因表达分析

由图2 可知，200 mmol·L-1NaCl 处理后，转基因植株的脯氨酸生物合成关键酶基因(吡咯琳-5-羧酸合酶NtP5CS)、 胚胎发育后期丰富蛋白基因(NtLEA5)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除系统关键酶基因(超氧化物歧化酶NtSOD和过氧化物酶NtPOD)相对表达量均极显著高于WT 植株，分别较WT 植株提高了122%～198%、205%～281%、255%～289%和161%～212%。 正常条件下，转基因植株与WT 植株所有基因的表达量无显著差异。 综上，过表达StSnRK1 基因通过上调脯氨酸生物合成、胁迫响应和ROS 清除系统基因表达，从而提高转基因烟草植株的耐盐性。

图1 过表达StSnRK1 转基因烟草植株耐盐性表型鉴定(A1、B1)，鲜重测定(A2、B2)，根数测定(A3、B3)和根长测定(A4、B4)Fig.1 Salt tolerance phenotype identification of transgenic StSnRK1 gene tobacco plants (A1，B1)，fresh weight determination (A2，B2)，root number determination (A3，B3) and root length measurement (A4，B4)

2.3 盐胁迫下转基因烟草植株SOD 和POD 活性分析

高盐胁迫使植物体内产生过多的ROS，而SOD 和POD 在降低超氧阴离子和过氧化氢对植物自身膜系统的损伤中扮演着重要作用。 由图3 可知，200 mmol·L-1NaCl 胁迫下，转基因烟草植株的SOD 和POD 活性极显著高于WT 植株，分别提高了41%～68%、83%～107%。 正常条件下，转基因植株和WT 植株的SOD 和POD 活性无显著差异(图3)。 表明过表达StSnRK1 基因显著提高了ROS 清除系统关键酶(SOD 和POD)的活性，从而降低ROS 造成的损伤，提高转基因烟草植株的耐盐性。

2.4 盐胁迫下转基因烟草植株脯氨酸、MDA 和H2O2 含量分析

高盐胁迫使植物体内产生过多的ROS，促进膜脂过氧化产生MDA，降低抗氧化物含量，加快细胞损伤。 由图4 可知，200 mmol·L-1NaCl 处理下，转基因植株的脯氨酸含量极显著高于WT 植株，较WT 植株提高了71%～121%。 转基因植株MDA 和H2O2含量极显著低于WT 植株，分别较WT 植株降低了41%～58%、31%～47%。 正常条件下，转基因烟草植株的脯氨酸、MDA 和H2O2含量与WT 植株无显著差异。 表明过表达StSnRK1 基因显著上调脯氨酸生物合成、胁迫响应和ROS 清除系统基因表达，增加脯氨酸含量、激活ROS 清除系统，降低膜脂过氧化程度，维持细胞渗透平衡，从而显著增强转基因烟草植株的耐盐性。

3 讨论

研究表明，SnRK1 基因在植物碳水化合物代谢途径中具有重要作用，通过调控途径中关键酶活性和基因表达，参与植物体内的生理代谢过程[5，7-11]。 一些研究报道发现，SnRK1 基因在应答非生物胁迫响应过程中也扮演着重要作用[12-14]。 本研究通过转基因烟草植株耐盐性鉴定、耐盐相关基因表达分析和抗性相关物质含量测定发现，StSnRK1 过表达能够显著提高烟草植株的耐盐性。

图2 盐胁迫下转基因烟草植株逆境胁迫相关基因表达分析Fig.2 Expression analysis of the stress related genes in transgenic tobacco plants under salt stress

高盐胁迫会诱导植物体内产生大量的ROS，打破ROS 产生与清除的平衡状态，引起细胞膜脂过氧化，产生大量MDA，破坏植物细胞结构[4，18-19]。 SOD 和POD 作为植物ROS 清除系统中的关键作用酶，能够迅速将H2O2转化为H2O 和O2，以抵抗逆境胁迫[18-20]。SOD、POD 活性，MDA 和H2O2含量等生理指标可作为判定植物耐盐性的重要指标[21-23]。 张淑辉等[14]研究发现，过表达PpSnRK1α番茄植株在盐胁迫处理后具有较高活性的抗氧化酶，表明转基因番茄植株具有较强的ROS 清除能力，PpSnRK1α过表达通过增强ROS清除系统能力，提高了转基因番茄植株的耐盐性。 本研究中，200 mmol·L-1NaCl 胁迫后，过表达StSnRK1烟草植株的SOD 和POD 活性极显著提高，MDA 和H2O2含量极显著降低。 同时，过表达植株ROS 清除系统的重要酶基因NtSOD和NtPOD上调表达，过表达StSnRK1 激活了ROS 清除系统，引起ROS 清除基因的上调表达，降低H2O2和MDA 含量，进而提高转基因烟草植株的耐盐性，这与前人研究结果相似。

在盐胁迫处理下，植物体内脯氨酸含量积累会迅速提升。 脯氨酸可以调节植物细胞内外的渗透平衡，同时保护细胞膜的完整性，从而缓解逆境胁迫给植物带来的伤害，因此脯氨酸积累可作为植物耐盐性的重要判断指标[21]。 研究表明，植物耐盐相关基因导入植物中，影响脯氨酸生物合成，积累较多的脯氨酸，进而提高转基因植株的耐盐性[18，24-31]。 本研究中，转基因烟草植株在200 mmol·L-1NaCl 处理后积累较多的脯氨酸，且脯氨酸生物合成关键酶基因NtP5CS上调表达，推测过表达StSnRK1 基因上调了NtP5CS基因表达水平，转基因烟草植株积累较多脯氨酸含量，调节细胞内外的渗透平衡和保护细胞膜的完整性，从而提高了转基因烟草植株的耐盐性。 此外，脯氨酸在清除单线态氧和羟基氧等ROS 清除系统中扮演着重要作用[28，31-33]。 转基因试验结果表明，耐盐相关基因导入植物中提高脯氨酸积累，激活增强ROS 清楚系统能力提高转基因植株耐盐性[25-27]，这与本研究结果一致，积累较多的脯氨酸激活ROS 清除系统，引起ROS 清除基因的上调表达和关键酶活性的增强，导致转基因烟草植株的耐盐性提高。

4 结论

本研究结果表明，StSnRK1 的过表达显著提高了烟草植株的耐盐性，SOD、POD 活性，脯氨酸含量；显著上调了脯氨酸生物合成、胁迫响应和活性氧清除系统相关基因的表达，表明可能通过增加转基因植株脯氨酸含量，以维持细胞渗透平衡和激活ROS 清除系统，从而显著提高转基因植株的耐盐性，说明马铃薯StSnRK1 基因在改良植物耐盐性中发挥着重要作用。本研究为马铃薯分子抗盐育种提供了理论依据，对于使用和开发盐渍土壤，提高农作物产量具有重要意义。

图3 盐胁迫下转基因烟草植株SOD(A)和POD 活性(B)分析Fig.3 The activities of SOD (A) and POD (B) in the transgenic tobacco plants under salt stress

图4 盐胁迫下转基因烟草植株脯氨酸(A)、MDA(B)和H2O2(C)含量分析Fig.4 The content of proline (A)，MDA (B) and H2O2(C) in the transgenic tobacco plantsunder salt stress