陈雪燕 刘艳艳 谭晴晴 任金瑞 姜欣欣 姜秀梅 刘中华 张全芳

(1山东农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室，山东济南 250100；2 山东济南梅园铁皮石斛种植有限公司，山东 济南 250100；3山东沃森农业科技有限公司，山东 德州 255039)

铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)系兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物[1-2]，主要分布在我国的南方区域，喜温暖湿润气候，长于密林树干或岩缝中。 铁皮石斛为我国传统贵细药材，常以干燥茎或枫斗入药，在中国许多著名医书上均有用药记载，具有生津益胃、养阴清热、润肺益肾之功效。 现代医学研究证明，铁皮石斛中含有的多糖、石斛酚、石斛碱、联苄类和菲类等化合物均与消化系统、衰老、免疫力、肿瘤、血糖、白内障、心脑血管系统疾病的治疗有关[3-4]。 2018年，国家卫计委建议将铁皮石斛列为药食两用原料名单，其药用、食用价值的应用将更为广泛。 在铁皮石斛行业的发展迎来新机遇的同时，也遇到了新的挑战，随着市场需求量的增大，野生资源的稀缺，供需关系矛盾导致市场上出现各种各样的“铁皮石斛”，加工出的枫斗更是真假难辨，大量的混淆品和伪品严重影响了铁皮石斛作为名贵药材的品质和价值。 如何保障铁皮石斛种质资源的真实性以及铁皮石斛产业的健康发展显得尤为重要。

药用石斛品种鉴定工作最早始于20 世纪30年代，日本学者木村康一对搜集来自中国、日本等不同产地中药石斛和枫斗进行了详细记述和生药学研究，可简单鉴别出铁皮石斛和其他石斛属植物。 此后，由于铁皮石斛的药用价值引起不少学者关注，鉴定铁皮石斛的研究方法也越来越多，主要有原植物鉴定、性状显微鉴定、色谱鉴定、光谱鉴定、液相鉴定以及分子标记鉴定等技术。 传统方法存在局限性、准确性低、仪器配套成本高、操作复杂等问题，分子标记法以不同物种遗传物质DNA 的差异来进行鉴定，不受物种个体形态、发育等的影响，具有用样量少、简便易行、准确性和多态性高等优点，被广泛应用于铁皮石斛的鉴定研究，如RAPD 标记[5-7]、ISSR[8-9]、SSR 标记[10-12]、AFLP 标记[13-14]、SRAP 标 记[15-17]、SCAR 标 记[18]、EST[19-20]标记以及DNA 条形码(DNA barcoding)[21]的研究均有报道。 实时荧光定量PCR 技术融合了核酸扩增、酶动力学、光谱分析技术的优势，在中医领域的中医诊断、中药药理、证实质、针刺作用机制研究等方面发挥了作用[22-23]。 目前该技术在基原鉴定方面还应用于动物、西红花、川贝母等研究[24-25]，而在铁皮石斛的基原鉴定上鲜有报道，尤其是TaqMan探针法更鲜见报道。 本研究探讨了DNA 条形码技术和TaqMan 探针法在鉴定铁皮石斛以及石斛属植物研究中的应用，以期为铁皮石斛的资源保护与利用提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为兰科植物15 个物种，其中石斛属14个、蝴蝶兰属1 个，共101 个样本，分别由山东沃森农业科技有限公司、济南梅园铁皮石斛种植有限公司和山东省农业科学院蔬菜花卉所提供(见表1)。 其中14 种石斛属植物由山东省百味堂中药饮片有限公司质量总监葛付存鉴定，凭证样本保存于样品采集基地。

表1 本研究的样品信息Table 1 Sample information for this study

1.2 主要仪器与设备

QuantStudioTM7 Flex 实时荧光定量PCR 仪，美国Thermo Fisher Scientific；T100PCR 仪、Tanon3500 凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司；5424 D 高速离心机，德国Eppendorf 公司； UV3600 紫外分光光度计，日本岛津；3730XL 测序仪，美国ABI 公司。 高效植物基因组DNA 提取试剂盒[DP350，天根生化科技(北京)有限公司]，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。 2×TaqMan Master Mix，上海DBI Bioscience 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序 称取样本鲜叶0.1 g，在液氮下研磨至粉末。 使用植物基因组DNA提取试剂盒提取总基因组DNA，提取的DNA 经紫外分光光度计测定OD260/OD280值，PCR 扩增体系(25 μL):2×Taq mastermix 12.5 μL、10 μmol·L-1正反向引物各取1 μL，DNA 模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。 扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50～55℃退火30 s(不同引物及退火温度见表2)，72℃延伸45 s，40 个循环；72℃终延伸10 min。 PCR 产物经电泳、纯化，测序由山东省农业科学院生物技术研究中心完成。

表2 ITS、psbA-trnH、matK 及rbcL 基因引物序列及退火温度Table 2 The primer sequences and annealing temperature of ITS、psbA-trnH、matK and rbcL gene

1.3.2 序列比对与分析 所测DNA 序列使用SeqMan 程序拼接、序列比对和人工校正，去除低质量峰区序列；在Genbank 数据库中下载15 种石斛属植物序列，序列信息见表3。 使用MEGA7.0 计算DNA 条形码中ITS、psbA-trnH、matK及rbcL4 个基因在铁皮石斛种内与14 种石斛植物种间变异，采用相似性搜索法(BLAST1)、K2P(Kimura2-parameter)双参数遗传距离分析鉴定能力，构建Neighbor-joining(NJ)进化树评估4 个基因在石斛属之间的亲缘关系。

表3 本研究使用的石斛类GenBank 登录号Table 3 GenBank accession numbers of Dendrobium species

1.3.3 PCR 引物及TaqMan 探针的设计 综合分析结果，选择最优的DNA 条形码ITS 作为靶基因，利用Primer 5.0 分别设计铁皮石斛特异引物(TP)和特异性探针(TPP)，设计石斛属通用引物(USH)及通用探针(USHP)。 引物及探针修饰见表4。

表4 引物与探针序列Table 4 Primers and probe sequences

1.3.4 多重荧光PCR 检测方法的建立 以野生铁皮石斛的基因组DNA 为模板，上、下游引物浓度以1.0 ～10.0 μmol·L-1为区间，以2.0 μmol·L-1浓度梯度递增；探针浓度以1.0 ～5.0 μmol·L-1为 区 间，以1.0 μmol·L-1梯度递增；退火温度以56 ～64℃为区间，以2℃逐渐递增，每次试验采取等量DNA 模板，设置一个变量，每个反应条件重复试验3 次。 对扩增所得数据进行分析，以阈值(Ct 值)最小、荧光信号强度最高和Ct 值标准偏差最小为依据，同时保证扩增效率和探针的特异性等，最终确定最佳退火温度。 通过对单一荧光定量PCR 反应体系中的Taq 酶用量、引物浓度、探针浓度和退火温度的优化，建立铁皮石斛的单重荧光定量PCR 方法。

在单一荧光PCR 建立的最优体系和确保试验特异性及稳定性的基础上，在同一反应体系中分别加入铁皮石斛特异引物、特异探针，石斛属通用引物和通用探针，并根据Ct 值和荧光增量，对各引物、探针浓度及循环参数进行调整优化，最终确定多重实时荧光PCR检测体系和方法。

1.3.5 多重实时荧光PCR 方法特异性和灵敏度检测 在供试的14 种石斛属植物各自样本DNA 中，分别随机选取1 份作为模板，按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性。 将铁皮石斛的基因组DNA 定量到5 ng·μL-1，按照5 倍逐级稀释作为标准品。 每个反应加量为2 μL，各浓度梯度样品均设置3 次重复，使用优化好的多重实时荧光PCR 体系及条件进行扩增，评价铁皮石斛特异引物和探针的灵敏度。

1.3.6 实际样品检测 将供试的14 种石斛属植物各自样本DNA 分别随机选取1 份作为模板，使用优化后的多重实时荧光PCR 检测方法测试实际样品，与测序方法对比，并验证方法的准确性、可行性，每个样本设置3 个重复。

2 结果与分析

2.1 样品序列比对、遗传变异、系统进化树分析

DNA 条形码中ITS、psbA-trnH、matK及rbcL的PCR 产物经正反方向测序后，利用MEGA7.0 软件比对序列和分析，将所测100 份样品石斛属植物序列和Genbank 数据库下载的相关序列进行种间、种内差异分析。 结果显示，ITS 区序列G+C 平均含量53.9%，均高于其他3 个基因；ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因变异位点数分别为为417、124、110、43，鉴定效率分别达到100%、92.85%、46.15%和14.28%(表5)。 在物种水平上通过BLAST1 分析，结合双参数遗传距离发现，ITS 基因在类群种间和种内差异最大，psbA-trnH次之，matK和rbcL最小。

将所测100 份样品石斛属植物的ITS 序列和Genbank 数据库下载的相关序列进行系统进化树分析，测序得到的不同属石斛ITS 条形码序列与下载的同属石斛序列分别准确的聚在一起，同源性达99%。表明ITS 条形码在本研究的铁皮石斛及其他石斛属聚类分析效果上具有准确、容易区分的特点(图1)。 综上，ITS基因作为石斛属最理想的DNA 条形码，具有明显的优势。

2.2 引物探针设计及多重荧光PCR 检测方法的建立

将比对后的ITS 区域序列作为靶基因，在可变区

设计铁皮石斛特异性引物和TaqMan 探针(图2)。 通过对引物浓度和探针浓度优化，确定最佳引物混合物终浓度为5.0 μmol·L-1，总反应体系为20 μL，包括2×Taqman Master mix 10.0 μL、10.0 μmol·L-1Primer Mix 1.0 μL、2.0 μmol·L-1Probe Mix 1.0 μL、1～20 ng·μL-1DNA 模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。 PCR 反应最佳反应条件:95℃预变性3 min；95℃变性10 s，65℃退火35 s，40 个循环，收集信号。 待测样本检测结果判定:在同时进行的空白、阳性对照试验结果正常的情况下，被检测样品应有相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct 值≤35，说明DNA 提取有效。

表5 ITS、psbA-trnH、matK 及rbcL 序列信息Table 5 ITS， psbA-trnH， matK and rbcL sequence information

图1 基于ITS 序列构建的石斛属及近缘物种NJ 进化树Fig.1 NJ tree based on ITS sequences from D. officinale and its closely related species

图2 铁皮石斛引物和探针设计Fig.2 Design the primers and probe of D. officinale

2.3 多重荧光PCR 特异性试验

按照2.2 的方法针对铁皮石斛的引物和特异性探针进行特异性验证，当羧基荧光素FAM 和罗丹染料ROX 荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct 值≤35说明检出铁皮石斛成分(图3)；当只有ROX 荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct 值≤35 说明未检出铁皮石斛成分(图4)。 表6 中特异性试验结果进一步说明铁皮石斛的引物与探针具有很好的特异性。

图3 铁皮石斛探针特异性扩增曲线图Fig.3 The specific amplification curve of D. officinale

2.4 多重实时荧光PCR 灵敏度测试

按照优化后的反应体系，将野生铁皮石斛基因组DNA 浓度定量到5 ng·μL-1，按照5 倍梯度稀释，共稀释6 个梯度，每个梯度做3 个重复，模板量取2 μL，6个梯度的模板量由高到低依次为10、2、0.4、0.08、0.016 和0.003 2 ng，进行实时荧光定量PCR 检测。结果显示，本方法的检测限可达到0.016 ng(图5)，较传统凝胶PCR 凝胶电泳检测灵敏度高很多(图6)，说明本方法具有很高的灵敏度。

2.5 验证试验

使用优化后的多重实时荧光PCR 检测体系进行实际样品测试，检测结果显示，实际样品有5 份均为铁皮石斛，14 份检出非铁皮石斛源性成分(表7)。 可见，该结果与测序结果一致，可准确检测出铁皮石斛源性成分，方法具有准确性和可行性。

表6 铁皮石斛引物及探针特异性试验Table 6 Primers and probe specificity test of Dendrobium officinale

图4 其他石斛属植物探针特异性扩增曲线图Fig.4 The specific amplification curve of Dendrobium species

3 讨论

近年来，由于植物叶绿体基因组具有结构简单、相对保守，易扩增和测序的特点，常用于属间的分类群研究。 目前，在石斛属鉴定研究方面，作为DNA 条形码应用较广泛的有ITS、ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH等基因。 不同的条形码在不同石斛属植物中的鉴定效率不同，Asahina 等[29]研究认为matK在石斛属的鉴别中优于其他条形码，更易将各个种的生物鉴别出来；付涛等[19]报道用matK+rbcL搭配petA-psbJ作为铁皮石斛种质资源分子鉴定的条形码组合。 因此，筛选合适的条形码作为靶基因对于鉴定研究显得尤为重要。 本研究根据前人的报道，选出DNA 条形码中常用的ITS、psbA-trnH、matK和rbcL4 个基因，分别分析其在供试石斛属样品的种间、种内差异以及鉴定效率、进化关系，筛选出ITS 基因为鉴定石斛属最理想的DNA 条形码。 这与丁小余等[30]和顾慧芬等[31]报道的结果相一致。

图5 铁皮石斛特异引物和探针灵敏度扩增曲线图Fig.5 The sensitivity amplification curve of specific primers and prober for D. officinale

表7 实际样本检测结果Table 7 The result of actual samples test

图6 铁皮石斛普通PCR 凝胶电泳Fig.6 General PCR gel electrophoresis of Dendrobium species

随着实时荧光定量PCR 技术的快速发展，该技术也被应用到石斛属的鉴定研究中。 Xu 等[32]曾将实时荧光定量PCR 技术(SYBR Green Ⅰ)与ARMS 技术相结合，对25 种石斛属植物的鲜样和枫斗进行了研究。Dong 等[33]也利用荧光定量技术建立了荧光熔解曲线分型方法用于石斛的研究。 本研究首次应用实时荧光定量PCR 中的TaqMan 探针法，以ITS为靶基因，利用其存在的多态性，在保守区设计出石斛属通用引物和探针，可变区设计铁皮石斛特异性引物和特异探针。通用探针对整个PCR 反应起到了质量控制的作用，使有石斛属成分的样品能被检测出荧光信号，从而排除了假阳性的存在，而铁皮石斛的特异引物和探针，保证了仅有铁皮石斛石斛源性成分的信号被检测出来。

近年来诸多研究表明DNA 条形码在区别种内、种间以及亲缘关系的鉴别方面起到了重要作用，将其作为靶基因具有可靠性。 但针对使用单一DNA 条形码鉴别存在的假阳性问题，实时荧光定量PCR 中的TaqMan 探针法具有特异性强、准确性和灵敏度高(高出普通PCR 检测限100 倍)、重复性好且高效经济的独特优势，其在铁皮石斛鉴定中的应用不仅弥补了该缺陷，同时节省了测序的时间和费用。 该方法的应用不仅为铁皮石斛新品种的鉴定和种质资源的利用与保护提供了科学依据，而且将对铁皮石斛的临床疗效和用药安全起到保驾护航的作用。

4 结论

本研究探讨了DNA 条形码与TaqMan 探针法在铁皮石斛鉴定中的应用，以ITS 序列作为靶基因，利用实时荧光定量PCR 技术，建立铁皮石斛多重实时荧光PCR 检测新方法，该方法可对铁皮石斛进行准确、高效地鉴定。