潘小慧 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV；or Hog cholera virus，HCV）引起的一种热性、高致死性和高度接触性传染疾病[1]。该病仅对猪有易感性，不同品种、年龄和性别的猪只均可感染[2]。猪瘟病毒属于黄病毒科（Flaviridae）、瘟病毒属（Pestivirus），是单股正链RNA病毒。基因组全长12.3 kb，编码4种结构蛋白（衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、E1、E2）和8种非结构 蛋 白 （Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）。其中 E2蛋白是CSFV诱导机体产生中和抗体的主要抗原，是研究新型基因工程疫苗和血清学检测方法的首选靶蛋白[3-6]。随着生物信息学的发展，有学者研究发现E2蛋白在113-145和338-360位氨基酸处存在两个主要跨膜区[7]，因此，对E2全基因进行体外表达可能存在困难。同时，早期研究表明E2蛋白存在A、B、C、D四个抗原区，4个抗原区均位于E2蛋白N端氨基酸残基第690-866位[8]，而C端氨基酸残基第866-1007位的部分基本上不参与这些表位的形成。因此，氨基酸残基第690-866位的部分是E2蛋白最具有抗原性的部分[9]。

本研究扩增了E2蛋白A-D抗原表位区 （第690-866氨基酸位点）的基因片段（以下将其对应表达的蛋白简称为E2AD蛋白），克隆到pET-28a表达载体中，并对E2AD蛋白的原核高效表达方法进行研究，同时对目的蛋白纯化条件进行探索，最后通过Western blot试验证明重组蛋白E2AD具有良好的反应原性，可为猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制提供抗原支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒种和质粒 猪瘟细胞毒株由本公司提供；大肠杆菌DH5α受体菌购于天根生化科技 （北京）有限公司；大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌购于北京全式金生物技术有限公司；pET-28a原核表达载体由福州大学生物科学与工程学院健康工程与技术研究所保存。

1.1.2 主要试剂 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit购自金瑞鸿捷（厦门）生物科技有限公司；AMV反转录 酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、dNTPs （2.5 mmol/L）、PrimeSTAR Max Polymerase、T4 DNA Ligase、EcoRI、BamHI和HindIII限制性内切酶、卡那霉素、IPTG和A-garose购自宝生物工程 （大连）有限公司；蛋白质Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Megan(美基生物)；氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、无水乙醇、冰醋酸、甲醇、甘油等均购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白凝胶试剂盒购于博士德生物工程有限公司；His融合蛋白纯化柱 （5 mL预装柱）购于上海七海复泰生物技术有限公司；TMB显色液购自上海碧云天生物生物技术有限公司；猪瘟病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所；羊抗猪IgG-HRP是KPL公司产品。

1.2 方法

1.2.1 E2AD基因引物设计 参照GenBank中公布的猪瘟E2基因序列 （登录号：AF531433.1），利用Oligo 7.0在E2基因核酸序列的2442-2972（氨基酸位置为690-866）区域设计引物。引物序列为E2AD-F：5'-CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAG GAAG-3'；E2AD-R：5'-GTCAAGCTTT TATAAATCTTCATTTTCCACTGTGG-3'，预期扩增片段大小约为546 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 猪瘟病毒RNA提取与反转录 按tacoTMDNA/RNA Extraction Kit仪器说明书提取细胞液中的猪瘟病毒RNA，所得RNA参照AMV反转录说明书进行反转录获得cDNA。

1.2.3 E2AD基因的扩增 以1.2.2中获得的cDNA为模板，用所设计的扩增引物进行PCR扩增，PCR反 应 体 系 50 μL：PrimeSTAR Max Premix （2 × ）25 μL，上、下游引物（20 μmol/mL）各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 23 μL。 PCR 反应条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变 性 10 s，58 ℃退火 5 s，72 ℃ 延伸5 s，30个循环；72℃ 延伸10 min，4℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测分析。

1.2.4 E2AD蛋白表达载体的构建与鉴定 将PCR产物参照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收纯化。纯化后的E2AD片段和pET-28a空载体分别经BamHI和HindIII双酶切，37℃酶切2 h。酶切产物使用1.0%琼脂糖凝胶跑胶分离目的片段，切胶回收载体和片段后使用T4 DNA Ligase进行16℃过夜连接。连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞涂板，挑取单菌落进行菌落PCR验证，验证引物为pET-28a载体通用引物。挑取验证为阳性的单菌落于5 mL LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）培养12~16 h，参照质粒提取试剂盒说明书提取阳性质粒后，使用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒送至测序公司测序，测序结果正确的阳性重组质粒命名为pET-28a-E2AD。

1.2.5 诱导表达及表达产物鉴定 将阳性重组质粒转化入大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞涂板，挑取阳性单菌落于5 mL LB培养基 （含50 μg/mL卡那霉素）中37℃、200 r/min摇床培养过夜。次日按照1%转接量接种于新的5 mL LB培养基内，37℃、200 r/min继续培养至OD600为0.4~0.6时加入终浓度 分 别 为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的 IPTG，37℃、200 r/min下诱导，并在诱导前及诱导后2、3、4、5 h分别取样1 mL菌液。将诱导前后的菌液以12 000 r/min离心10 min，弃上清，取沉淀利用20 μL PBS液进行重悬后加入等量的 2×Loading Buffer，混匀后在沸水中煮15 min。待冷却后分别取10 μL样品进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色、脱色液脱色后检查特异性目的蛋白条带约为25 kDa。

1.2.6 E2AD蛋白的大量表达与纯化 按照1.2.5中优化的诱导方法对pET-28a-E2AD进行大量诱导表达，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集菌体。然后用PBS吹打清洗菌体2遍，离心收菌。在收集后的菌体中加入30 mL PBS重悬菌体，吹打均匀后收集进入50 mL离心管中，冰浴30 min后300 W超声波裂解15 min直到菌液变澄清。取1 mL超声液离心，取上清和沉淀分别制样后进行SDS-PAGE电泳，确定E2AD蛋白是包涵体表达。将剩下的超声液-20℃保存过夜。次日，冷水浴缓慢溶解超声液后4℃、12 000 r/min离心 10 min，弃上清，取沉淀；加入2 M尿素洗涤沉淀2遍，再次离心溶液、收集沉淀，加入8 M尿素溶液溶解后离心，取上清，弃沉淀。参照His融合蛋白纯化柱（5 mL预装柱）说明书纯化上清，获得粗提纯蛋白溶液，然后利用透析袋梯度纯化方法进行蛋白质复性后，收集E2AD融合蛋白于-20℃保存。

1.2.7 免疫印迹法鉴定重组蛋白E2AD 将纯化的重组蛋白E2AD进行SDS-PAGE电泳，使用Bio-Rad点转仪将蛋白转至NC膜，按分子克隆实验指南进行免疫印迹，一抗为猪瘟病毒阳性血清，二抗为羊抗猪IgG-HRP。

1.2.8 E2AD蛋白浓度的测定 参照BCA蛋白浓度测定试剂盒操作说明书对E2AD蛋白浓度进行测定。

2 结果与分析

2.1 E2AD基因的扩增 以反转录的猪瘟cDNA为模板，E2AD-F和E2AD-R为引物，通过PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检验，结果表明扩增产物大小约546 bp，与预期扩增结果相符（见图1）。

图1 PCR扩增E2AD基因片段

2.2 pET-28a-E2AD表达载体的构建与鉴定 纯化后的E2AD基因片段与pET-28a空载体双酶切进行凝胶验证，回收目的片段连接。连接产物转化进入感受态细胞后，通过PCR验证得到阳性克隆菌落的条带大小约834 bp（见图2）。对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行单酶切、双酶切验证（见图3）；验证正确后送至测序公司测序，比对显示，pET-28a-E2AD中E2AD基因序列正确。

图2 pET-28a-E2AD菌落PCR扩增结果

图3 pET-28a-E2AD酶切验证结果

2.3 E2AD蛋白的诱导表达

2.3.1 IPTG浓度的确定 将pET-28a-E2AD表达菌摇至 OD600为 0.4～0.6时加入 IPTG诱导 4 h，SDS-PAGE电泳显示，在25 kDa处出现目的蛋白条带，且IPTG浓度为0.2 mmol/L时目的蛋白表达量最多，随着IPTG浓度的增大，蛋白表达量逐渐降低或者没有增加的趋势，因此，确定IPTG最佳诱导浓度为 0.2 mmol/L（见图 4）。

2.3.2 诱导时间的确定 将pET-28a-E2AD表达菌用浓度为0.2 mmol/L的IPTG分别诱导2 h、3 h、4 h和5 h，取诱导前后菌液制样经SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示，诱导4 h和5 h时蛋白表达量最多，因此，确定IPTG诱导时间为4 h即可（见图5）。

图4 pET-28a-E2AD的IPTG诱导浓度的确定

图5 pET-28a-E2AD的IPTG诱导时间的确定

2.4 E2AD蛋白的纯化 大量表达E2AD蛋白后使用Ni-NTA蛋白纯化柱纯化，经SDS-PAGE电泳检测，前3管洗脱液中的纯化效果较好（见图6）。

图6 E2AD蛋白纯化

2.5 E2AD蛋白的免疫印迹分析 用猪瘟阳性血清为一抗、羊抗猪IgG-HRP为二抗对重组蛋白E2AD进行Western blot检测，结果表明，在25 kDa处出现反应条带（见图7），说明蛋白具有活性。

图7 E2AD蛋白的Western blot鉴定

2.6 蛋白浓度测定 经检测，纯化的蛋白浓度为0.2 g/L。

3 讨 论

猪瘟对养猪业危害严重，是世界粮农组织和各国政府严密监控和检疫的主要传染病之一。目前免疫学检测和核酸检测是疫病检测的主要检测方法，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）以其操作简便、敏感性高、适于大规模样品检测的优点成为检测抗体的主要免疫学方法，也是监测猪群抗体水平的主要技术手段。用于ELISA的包被抗原主要是全病毒和重组蛋白，由于CSFV在体外细胞上不产生病变，增殖能力差，对培养条件要求高[10]，从而导致以病毒培养液作为包被抗原的ELISA结果不是十分稳定。因此，许多研究者相继研发出以重组蛋白E0或E2作为包被抗原的CSF抗体检测试剂盒[11-13]。猪瘟病毒的12种蛋白中，E2蛋白是CSFV粒子表面一种包膜糖蛋白，是病毒吸附、进入宿主细胞的关键蛋 白[14-15]。E2糖蛋白是一种免疫优势蛋白，能够诱导动物机体产生特异性中和抗体，一直是研究的热点。随着生物信息学的发展，研究学者对E2全蛋白的抗原结构的研究更加深入。研究发现猪瘟病毒E2糖蛋白氨基端存在A、B、C、D四个抗原结构域，其中D/A区是猪瘟病毒基因组中高度保守的区域，B/C区位于决定病毒株抗原特异性的区域[16]。因此，本研究选择E2糖蛋白的A-D抗原表位区而非E2全蛋白进行克隆表达，不仅减少了表达蛋白的分子量，便于蛋白的表达和纯化，而且以E2主要抗原区为包被抗原能增加抗体检测的特异性。

大肠杆菌表达系统以其周期短、效率高、操作简便等优点成为工业生产中比较理想的表达方式。影响外源基因在其中高效表达的因素主要有表达载体、宿主细胞的选择和表达条件（诱导时间、诱导温度和诱导剂IPTG的浓度等）[17]。本研究使用带有His标签的pET-28a载体表达融合蛋白，有利于目的蛋白的分离纯化；同时选用经过基因改造的大肠杆菌Transetta（DE3）作为表达宿主菌，补充了菌体中缺乏的6种稀有密码子对应的tRNA，以期达到提高外源真核基因E2AD表达水平的目的。在表达条件的优化上，本研究首先使用不同浓度的诱导剂IPTG进行诱导，发现并非IPTG的诱导浓度越高蛋白的表达量就越多，过高浓度的IPTG对菌体生长还会有抑制作用。同时对诱导时间进行梯度试验，发现诱导时长4 h与5 h差异不大。所以，试验最后确定IPTG的诱导浓度为0.2 mmol/L，诱导时间为4 h。

利用大肠杆菌表达系统虽然能够高效表达重组蛋白，但是重组蛋白通常以包涵体形式存在。本研究中E2AD蛋白也是主要以包涵体形式表达的，因此包涵体的变性、纯化和复性是使重组蛋白具有生物学活性的关键步骤。包涵体的处理一般包括菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、纯化以及复性。本试验对菌体的破碎条件进行了探索，经过多次对比发现，在200 W超声5 s、停8 s条件下，超声破碎99次后将超声后液体放入-20℃再进行冻融裂解效果比较理想。经破碎和冻融后的包涵体中除了目的蛋白外，还有核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、脂质和脂多糖等杂质[18]，这些可能对目的蛋白的纯化造成干扰。通常人们使用中等浓度的变性剂如TritonX-100或者尿素等缓冲液洗涤包涵体几次来除去杂质。由于试验中使用8 M尿素作为变性剂，为了不引入新的离子，本试验使用2 M尿素洗涤包涵体2遍，然后再使用8 M尿素完全溶解后上柱洗脱，最终获得了较多的目的蛋白。

4 结 论

本研究成功构建了表达E2基因主要抗原区的原核表达载体pET-28a-E2AD，并通过对表达条件和包涵体纯化条件的探索，最终获得纯度高、具有活性的重组蛋白E2AD，为后续猪瘟抗体ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。