曾宪煜 陈秋勇 王隆柏 车勇良 陈如敬 吴学敏 王晨燕 刘玉涛 周伦江＊

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013；2.长汀县动物疫病预防控制中心，福建长汀 366300）

猪腹泻是一种常见的猪肠道疾病，致病机理复杂，可通过细菌、病毒和寄生虫等方式感染，其中猪病毒性腹泻因其感染速度快、范围广，对养猪行业的危害尤为严重。引起猪病毒性腹泻的病毒种类较多，其中猪流行性腹泻病毒 （Porcine Epidemic Diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PoRV）是引起猪病毒性腹泻的主要病原[1-2]。1971年PEDV在英国最早被发现，发病仔猪腹泻、呕吐和脱水；1973年首次在我国上海报道发生，随后在吉林、江西、河北、山东、湖南、广东和福建等地均检测到了该病的发生[3-5]。与此同时TGEV和PoRV开始在国内陆续被发现和报道，由于临床症状相似，发病猪群食欲不振、消瘦、呕吐和排水样粪便，很难通过临床方法区分，目前主要的检测方式是通过抗原PCR检测和免疫血清学检测抗体。为进一步了解福建省猪病毒性腹泻的流行情况，本研究通过2012-2018年对采自福建省179家猪场2 003份发生腹泻的病料进行PEDV、TGEV和PoRV病原学检测，研究分析PEDV、TGEV和PoRV在猪群中的感染和流行规律，为猪病毒性腹泻的防控提供科学的数据基础和参考意义。

1 材料与方法

1.1 组织样品 收集来自福建省2012-2018年179家猪场疑似PEDV、TGEV和PoRV的2003份腹泻病料，主要包括病变肠道及其内容物。

1.2 主要试验仪器及试剂 DNA/RNA提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、2×Super Taq PCR Mix Genstar和DNA Marker-2000购自北京全式金生物技术有限公司，Random Primer、5×RT Buffer、dNTPs、RNase Inhibitor和Reverse Tra Ace等试剂购自东洋纺 （上海）生物科技有限公司。

1.3 引物设计 参考Genbank中PEDV（GenBank：KJ645708）、TGEV （GenBank：AF209745） 和 PoRV（GenBank：KU886318.1）参考序列，设计特异性引物（见表1），由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 引物序列和片段大小

1.4 核酸提取 采用购自北京全式金生物技术有限公司的病毒RNA/DNA提取试剂盒，参照说明书，提取组织样品中的总DNA/RNA，-70℃保存备用。1.5 RT-PCR 采用购自东洋纺(上海)生物科技有限公司的RT-PCR扩增试剂盒，按照试剂盒说明书配制反应体系 （见表2），反应条件：30℃、10 min，40℃、20 min，99℃、5 min，反应结束后在4℃保存。

表2 RT反应体系

按照试剂盒说明书配制PCR反应体系 （见表3），反应条件：95℃预变性5 min，一个循环；94℃变性50 s，退火（温度分别为PEDV 53℃，TGEV 51℃，PoRV 51 ℃）50 s，72 ℃、1 min，40 个循环；72 ℃延伸10 min，反应结束后在4℃保存备用。取扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。

表3 PCR反应体系

2 结果与分析

2.1 病原方面分析 采用RT-PCR方法对来自福建省179家猪场的2 003份疑似猪病毒性腹泻病料进行检测，其中PEDV、TGEV和PoRV扩增目的条带大小分别为 595 bp、739 bp和 309 bp（见图 1）。检测结果显示（见表4）：收集的2 003份腹泻病料中PEDV 阳性率为 72.74%（1 457/2 003）；TGEV 阳性率为 7.89%（158/2 003）；PoRV 阳性率为 2.4%（48/2 003）。表明福建省猪场引起猪病毒性腹泻的主要病原为PEDV，阳性率最高，其次是TGEV，最后是PoRV。其中PEDV 2016年阳性率较高，为77.19%（247/320）；TGEV 2012年阳性率最高，为 20.27%（60/296）；PoRV 2012 年阳性率最高， 为 5.41%（16/296）。PEDV在2012-2018年期间阳性率均最高，TGEV阳性率次之，且呈逐年递减趋势；PoRV阳性率在2012年最高，且在2013-2018年期间有所降低，阳性率趋近于2%（见图2）。

图1 PEDV、TGEV和PoRV样品检测电泳图

表4 猪腹泻病料RT-PCR检测结果

图22012 -2018年PEDV、TGEV和PoRV阳性率

2.2 发病季节分析 检测结果显示（见表5），一年中在冬春季节发病最为严重，PEDV发病率最高，冬季为 67.19%（979/1 457）， 春 季 为 23.47%（342/1 457）；TGEV 发病率，冬季为 70.25%（111/158），春季为22.78%（36/158）；PoRV发病率，冬季为64.58%（31/48），春季为 29.17%（14/48）。 结果显示，猪病毒性腹泻在冬春两季暴发严重，发病率高，这可能与冬季气候寒冷、春季气候变化大、忽冷忽热有关。

2.3 发病日龄分析 不同日龄猪群均可感染PEDV、TGEV 和 PoRV，7 d内仔猪和 7～25 d哺乳仔猪的发病率较高 （见表6），分别为PEDV 51.54%（751/1 457） 和 32.53%（474/1 457）、TGEV 55.06%（87/158） 和 34.81%（55/158）、PoRV 62.50%（30/48）和29.17%（14/48）。结果表明，仔猪在出生25 d内易受病毒感染引起腹泻，到了保育期后，PEDV、TGEV和PoRV发病率均有明显下降。

表5 PEDV、TGEV和PoRV在不同季节的发病率

3 讨 论

猪病毒性腹泻是猪场常见的疫病之一，被感染的猪群严重呕吐、腹泻、脱水，导致死亡，对养猪行业造成巨大的经济损失。本研究通过RT-PCR检测方法对收集的省内179家猪场2 003份疑似猪病毒性腹泻病料进行病原学检测。结果表明：PEDV的阳性率最高，为 72.74%（1 457/2 003），TGEV 的阳性率为7.89%（158/2 003），PoRV 的 阳 性 率 为 2.40%（48/2 003），主要集中在冬春季节。近年来，朱子健等、刘邓等、王淞等、赵志敏、张佩华等、王伟等、周玲等、薛翼鹏等、廖勤丰等、陈杰、倪建强等对国内各地猪病毒性腹泻流行情况进行调查[2，6-15]，发现PEDV发病率最高，TGEV和PoRV发病率均较低，冬春季节多发，本次调查研究也证实了这一点。从发病日龄分析，PEDV、TGEV和PoRV发病率主要集中在25日龄内仔猪，其中7日龄内发病最严重。王瑞等调查发现，从发病猪场母猪乳水中可以检出猪病毒性腹泻病原[16]，说明仔猪可通过母乳感染猪病毒性腹泻病原，同时，新生仔猪抵抗力较低，缺乏相应抗体，易受母猪乳水或者环境中PEDV、TGEV和PoRV感染威胁，应加强免疫防护措施。本研究通过分析福建省猪病毒性腹泻流行情况，为我省猪病毒性腹泻防控提供科学的数据基础和参考意义。

表6 PEDV、TGEV和PoRV在猪不同日龄发病情况