张小兰 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

PK15细胞为猪肾上皮细胞，父母代源自1955年美国Stice提供的成年猪肾细胞PK-2a，被ATCC 收藏（CCL-33）[1]。PK15 细胞对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒等多种病毒比较敏感，已广泛应用于兽用疫苗的研究和生产[2]。随着疫苗工艺研发的不断创新，生物反应器因有其自身的优势如可以稳定控制培养条件、高密度培养、规模化生产等被广泛应用于生产领域。然而，一般种子的扩增也需要从方瓶培养、转瓶培养再到反应器培养的过程。本文探讨了PK15细胞在方瓶、转瓶、生物反应器培养条件下的细胞生长情况，为制定优化的培养策略奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和培养基

1.1.1 细胞 PK15细胞株，由大北农集团北京动物医学研究中心提供。

1.2.1 培养基 MEM购自gibco公司。

1.2 细胞培养

1.2.1 方瓶培养 复苏一支PK15细胞至T75方瓶中培养，传3代至细胞密度稳定后，按细胞最佳传代比例分种至3个T75方瓶中培养。待培养72 h，细胞刚好长满单层且状态良好时，3瓶T75方瓶细胞分别按正常方式消化传代，即弃去细胞培养液，用37℃预热处理的PBS清洗细胞2遍，每遍25 mL，再用0.25%胰酶4 mL消化细胞，待细胞出现圆缩分离时弃去消化液，加6 mL含5%血清的营养液终止消化并进行吹打细胞。每瓶细胞消化后分别取1 mL细胞悬液至EP管中待计数，其余细胞悬液按比例1：15分种至T75方瓶中继续培养，培养液总量为25 mL，5%CO2、37 ℃培养。 每隔 24 h、48 h、72 h 观察每瓶细胞状态并记录结果。每瓶细胞连续消化传代3次，每次传代比例为1：15，每次取消化后的细胞悬液计数，收集每次的细胞分种密度、培养72 h细胞密度、细胞增长倍数和观察细胞24 h、48 h、72 h的生长状态。

1.2.2 转瓶培养 同上述方瓶培养，来自同一支复苏细胞，逐渐按一定的比例扩增至15 L转瓶培养，待转瓶培养2代密度稳定后，按最佳分种密度分种至3个15 L转瓶中培养。待培养72 h细胞长满致密单层且状态良好时，3瓶细胞分别按正常方式消化传代，即弃去细胞培养液，用37℃预热处理的PBS清洗细胞2遍，每遍200 mL，再用 0.25%胰酶100 mL消化细胞，待细胞出现雾层时弃去消化液，加500 mL含5%血清的营养液终止消化。每瓶细胞消化后分别取1 mL细胞悬液至EP管中待计数，其余细胞悬液按比例1：8分种至15 L细胞瓶中进行培养，培养液总量为1 500 mL，培养条件为12 r/min、37℃温室。 每隔 24 h、48 h、72 h观察细胞状态并记录结果。每瓶细胞连续消化传代3次，每次传代比例为1：8，每次取消化后的细胞悬液计数，收集每次的细胞分种密度、培养72 h细胞密度、细胞增长倍数和观察细胞24 h、48 h、72 h的生长状态。

1.2.3 生物反应器培养 同上述方瓶、转瓶培养，来源于同一支复苏细胞，取培养72 h长满单层且状态良好的15 L转瓶细胞2瓶，按正常方式消化传代，收集细胞悬液并计数，以（5～6）×105个/mL接入反应器中培养，培养体积为2 000 mL，培养条件设置为pH 7.4、溶氧（DO）50%空气饱和度、温度37℃、转速50 r/min。反应器最大培养体积为7 L，购自广州齐志工程设备有限公司。培养过程中采用通过空气、O2、CO2方式调控pH与溶氧，当pH与溶氧不能有效被控制时，采用添加7.5%NaHCO3进行调控。每隔24 h取样计数并观察细胞状态。生物反应器按相同条件重复培养3次，每次收集细胞上罐密度，24 h、48 h、72 h的细胞密度、增长倍数和细胞状态。

2 结 果

2.1 PK15细胞在方瓶中培养的生长情况 由表1可见，采用方瓶培养细胞，当分种密度在 （1～5）×104个/mL时，经过72 h培养，细胞密度均能增值到（0.5～1.5）×106个/mL， 增长 10～30 倍，24 h、48 h、72 h的细胞状态都良好。

2.2 PK15细胞在转瓶中培养的生长情况 由表2可见，15 L转瓶培养细胞， 当分种密度在 （5～9）×104个/mL时，经过72 h培养，细胞密度均能增值到（0.5 ～1.0）×106个/mL，增长 5～10 倍，且细胞状态均良好。

2.3 PK15细胞在生物反应器中培养的生长情况由表3可见，生物反应器培养PK15细胞，接种密度为（5～6）× 105个/mL，每隔 24 h 细胞能增长 2～3 倍，培养到72 h细胞能增长8～12倍，各时间段细胞状态良好。

3 小结与讨论

结果表明，PK15细胞在方瓶、转瓶、生物反应器中培养均能很好生长，培养72 h细胞最高密度分别能达到 1.5 ×106个/mL、1 ×106个/mL、8 ×106个/mL，且细胞在每个时间段都处于良好状态。三种培养体系中，细胞增长倍数最大的是方瓶，增长10～30倍；其次是生物反应器，增长8～12倍；最后是转瓶，增长5～10倍。

表1 PK15细胞在方瓶中培养的生长情况

表2 PK15细胞在转瓶中培养的生长情况

表3 PK15细胞在生物反应器中培养的生长情况

细胞体外培养环境中，pH是培养细胞的关键因素之一，它能影响细胞的粘附、存活与生长等功能。方瓶培养细胞可以通过5%CO2进行pH平衡调控，对于转瓶显然该方法行不通，而生物反应器是三种培养体系中最理想的培养系统。它不仅能稳定pH，还可以稳定溶氧、温度、搅拌速度等，当营养不足时可以及时补充营养如葡萄糖等使细胞处于最佳环境状态。因此，稳定的环境系统和营养物质的充分利用使反应器培养的密度达到更高。试验结果中反应器培养密度最高能达到8×106个/mL也不足为奇。另外，方瓶培养是静置培养，培养条件温和，与生物反应器相比，细胞不受剪切力影响、液面的表面积大、溶氧基本可以满足细胞要求[3]，试验结果显示方瓶培养细胞增长倍数最大，也许就是与这些因素密切相关。本试验结果可以为生产制定PK15细胞的培养优化策略提供参考依据。