薛晓阳 王娟娟 李明珠 王雪敏 李佳佳 （华裕农业科技有限公司 河北 邯郸 056000）

2019年初山东某商品蛋鸡场130日龄的鸡出现零星死亡。临床症状为腿部、脚部、肛周有血泡，疑似血管瘤，但剖检无肿瘤症状。在200日龄检测11只弱鸡，无菌采集抗凝血进行病毒分离工作，培养2代，细胞上清液经ELISAP27抗原检测为60%以上阳性，该病例结合临床症状怀疑为J亚型白血病病例。

禽白血病(A vianleukosis virus，ALV)是由禽C型反录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。禽白血病的传播方式分为垂直传播及水平传播，其中经卵垂直传播是禽白血病的主要传播方式，家禽感染禽白血病后可造成鸡只生长发育迟缓、产蛋性能下降、免疫抑制等影响[1]。同品种鸡的饲养呈现规模化、集约化发展，蛋鸡、地方品种鸡感染J亚群ALV的病例报道不断增多[2]。禽白血病导致的经济损失主要有2个方面：一是产生肿瘤，导致鸡的死亡；二是产生非肿瘤综合征。此外，禽白血病一当感染后，可引起鸡群的免疫抑制，会继发诸如马立克氏病、传染性法氏囊、鸡传贫等免疫抑制病，从而造成更严重的损失[3]。本检测病例具有该特点，无明显肿瘤症状，就诊断过程做一分享。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 DF-1细胞由山东农业大学肿瘤与免疫抑制病实验室惠赠。肝素钠抗凝管购自江苏宇力医疗器械有限公司。EDTA-K2抗凝管购自山东省成武县医用制品厂。6孔细胞培养板购自美国康宁公司。DMEM高糖培养基生产厂家gibco，产品货号8119159，有效期至2020.5。0.25胰酶生产厂家gibco，产品货号2008319，有效期至2020.9.30。青链霉素生产厂家gibco，产品货号2068817，有效期2020.1.30。两性霉素B生产厂家procell，有效期至2020.6。胎牛血清PAA品牌，生产日期SF181212。

1.1.2 实验设备 二氧化碳培养箱品牌松下，型号MCO-18AC。倒置显微镜品牌NIKON，型号TS2。高压灭菌锅博讯品牌，型号YXQ-LS-50SII。超纯水系统艾科浦公司生产，型号AWL-0501-H。电热干燥箱，上海博讯生产，型号GZX-9140MBE。超净工作台上海博讯公司生产，型号SW-CT-LFD。医用离心机湘仪设备，型号H1850。酶标仪BIOTeK品牌，型号ELX800，洗板机为BIOTeK品牌，型号ELX50。移液器，eppendorf品牌。

1.1.3 试剂盒 LLAg试剂盒为IDEXX产品，货号LP244，有效期至2020.5.18。

1.1.4 检测鸡 11只商品蛋鸡。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及接种细胞[4]（1）抗凝血：1500-2000r离心2min，取中间靠下层，注意不要取到红细胞.本检测使用12孔板接90μl，每孔加入过滤的肝素钠抗凝剂20μl(12.5U/ml)。（2）接种完 样品后2h更换维持液，用灭菌的PBS清理清洗细胞板3次，每孔1ml/次，加入1%细胞维持液维持5d，维持5d后进行传代。（3）共传2代，每一代的上清液留样检测。

1.2.2 细胞上清液白血病检测 试剂为IDEXX产品，严格按照试剂说明进行。

2 检测结果

2.1 细胞上清液P27蛋白检测结果

表1 2代细胞培养液P27检测结果

2.2 阳性率及S/P值统计

表2 阳性率及阳性样品S/P值统计

3 讨论

（1）检测结果阳性鸡只占到检测鸡只63%以上，并且第一代样品S/P值较高，远远高于试剂盒 判定标准，且第二代阳性样品S/P值进一步提高，达到2.16，可以确定为强阳性。可以证明该鸡群可能存在大比例阳性鸡只，生产性能可能会受到影响。因为DF-1可以排除禽内源性白血病检出，因此检出的白血病属于致病性的可能性较大，因该检测没有进行后续病毒分型鉴定，但结合临床症状初步怀疑是白血病J亚型的一个血管瘤症状。（2）ALV-J引发的肿瘤/血管瘤给中国养鸡业带来了很大的危害。在过去十多年里，全国已报道了100多个ALV-J毒株的分离鉴定，同时何爱飞等也有禽白血病所致血管瘤的报到[5]，王培坤等在三黄鸡临床血管瘤病例分离出A亚群与J亚群白血病病毒 ，说明临床血管瘤有一定的病例，但是在一般企业实验室诊断全面诊断技术较为困难，病理切片技术相对复杂，并且在结果读取专业性要求较高，一般企业员工对深层次分子理论掌握不够，PCR方法白血病鉴定对分子理论要求较高，而细胞培养结合ELISA联合诊断在企业应用较为适用。（3）结合本案例白血病临床解剖不一定有明显的肿瘤症状，11只被检鸡只精神良好，但偏瘦，血管瘤也无很明显症状，临床从130d开始出现零星死亡，持续不断，远高于正常死亡标准，从病毒分离结果，第一代便有高比例阳性检出，且S/P值较高，因DF-1细胞可以排除内源性感染，因此初步怀疑J亚群白血病的感染，同时也说明DF-1细胞结合ELISA验证，高S/P值也是鉴定标准之一，在临床检测可以攻毒重视。