何晓婷，王均慧，李 娇，魏倩倩，冯 雪，曹 挥

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

三七（Panax notoginseng）又名田七、金不换，属五加科（Araliaceae）人参属（Panaxlinn）多年生阴性草本植物，是一种传统的中草药[1-2]，具有重要的经济价值及药用价值，现已成为云南、广西、福建等地的支柱型产业[3-4]，主要采取人工栽培和集约化的种植方式。由于长期大面积的单一种植，加之三七喜阴暖潮湿[5]，使得三七病害发生严重，特别是根腐病[6]，是三七生产中毁灭性的病害，严重影响三七种植业的发展。

三七根腐病致病因子复杂，其发生与病原菌、生长环境、施肥、灌水量适宜与否等都有重要的联系，致使防治工作极难展开。植物保护工作者根据多年的工作经验认为，在防治根腐病时要灵活运用“预防为主，综合防治”的措施，如农业防治、生物防治、化学防治等措施的合理应用。农业防治中多采用轮作的方式预防根腐病的发生，但是轮作要求年限比较长，一般是8～10 a，耗费时间、人力、物力，且经济效益不理想[7]。生物防治主要采用施用生物菌肥[8]、抑菌内生真菌[9]等措施。也有研究发现，生物质材料对三七土传性病害具有良好的控制作用[8]。化学防治多采用化学药剂灌根或进行土壤熏蒸等方式处理[10]，严重影响药材品质，且破坏土壤结构、抑制土壤中微生物的繁殖。

目前利用植物提取物或精油防治植物病虫害的研究逐年增多。而植物来源的天然产物既有预防作用又有治疗作用，同时又具有较低的毒性和副作用[11]。近年来，研究者们非常关注从植物中分离的提取物和生物活性化合物，并分析其药理活性[12]。GRZESIK 等[13]研究表明，植物的治疗作用归因于其所产生的次级代谢产物，主要分为生物碱、萜类和酚类。TLILI 等[14]研究了几种突尼斯传统芳香植物，结果表明，供试植物中显著存在次生代谢产物，且涉及多种生物活性。

本试验主要通过多种植物源粗提取物对三七根腐病病原菌进行抑菌活性测定，筛选出其中具有良好抑菌效果的一种或几种，作为后续研究防治该病害的原材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌种为三七根腐病病原菌，由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。

供试植物材料有苦楝子（Melia azedarach Linn）、百里香（Thymus mongolicus Ronn）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、地肤子（Kochia scoparia Schrad）、决明子（Cassiae Semen）、芫花（Daphne genkwa）、瑞香狼毒（Stellera chamaejasma L.）、八角茴香（Illicium verum Hook.F.）、博落回（Macleaya cordata（Willd.））等9 种植物药材，购自安国市聚福中药材有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的提取 称取植物粉末，按照提取物干粉与有机溶剂（工业酒精）1∶5（m/V）的量装入广口瓶中，充分浸泡24 h，30 ℃超声波辅助提取30 min 后，用循环水式真空泵抽滤，将剩余滤渣收集再次进行超声波提取，再进行抽滤，上述步骤共重复5 次，收集滤液；用旋转蒸发仪对滤液进行减压真空浓缩，收集浓缩液得到植物提取物原液，测定原液质量浓度后于4 ℃保存备用。

1.2.2 培养基的制备 试验所用培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），配制方法参考文献[15]进行。

1.2.3 9 种植物提取物对三七根腐病病原菌菌丝生长抑菌活性的测定 采用菌丝生长速率法[16]进行抑菌活性测定。采用十字交叉法测量72、96 h 时经过9 种提取物处理的病原菌的菌落直径（mm），根据公式计算每种植物提取物在2 mg/mL 时的抑制率。

1.2.4 苦楝子提取物对三七根腐病病原菌的毒力测定 针对三七根腐病菌，选取抑制效果最好的植物提取物，利用二倍稀释法将苦楝子提取物配制成1、0.5、0.25、0.125、0.063 mg/mL 等5 个质量浓度，制作加药培养基，其中，PDA 培养基为空白对照，测量24、48、72、96 h 时苦楝子提取物处理的病原菌的菌落直径，并计算抑制率，统计分析得到不同植物提取物对病原菌的毒力方程和抑制中浓度EC50。

1.3 数据分析

运用Excel、SAS、SPSS 17.0 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 9 种植物粗提取物对三七根腐病菌的抑制效果

从表1 可以看出，通过对比分析，质量浓度为2 mg/mL 时，苦楝子提取物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制效果最好，72、96 h 均无菌丝生长，抑制率均为100%。

表1 9 种植物提取物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制作用

2.2 不同质量浓度苦楝子对三七根腐病病原菌的抑制效果

表2 不同质量浓度苦楝子提取物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制作用

从表2 可以看出，苦楝子提取物随着质量浓度的增大，对三七根腐病病原菌的抑制效果在逐渐增强，在1 mg/mL 时对三七根腐病病原菌的抑制率在60%以上，抑制作用显著；在低质量浓度下抑制作用不显著，抑菌效果较差。

2.3 苦楝子提取物对三七根腐病病原菌的毒力分析

选取96 h 的数据运用SAS 软件进行统计分析，分别得出毒力回归方程和抑制中浓度（EC50），结果显示，苦楝子提取物对三七根腐病病原菌的毒力回归方程为：Y＝5.449 2＋2.054 2X，根据毒力回归方程进一步计算得出苦楝子提取物对三七根腐病病原菌的EC50为0.60 mg/mL，相关系数为0.982 1，接近于1。

2.4 苦楝子提取物对三七根腐病病原菌菌丝形态的影响

三七根腐病病原菌菌丝形态为：菌丝顶端平滑，呈蠕虫状，菌丝细长，菌丝内部无横隔（图1-A）。

在显微镜下观察用药处理96 h 后质量浓度为1 mg/mL 的菌落菌丝形态，结果表明，苦楝子提取物处理的菌丝与对照相比，菌丝顶端膨大，表面不光滑，中部出现异常突起，出现分枝、短小且缢缩，菌丝内部壁上出现黑色斑点，附着在菌丝细胞膜上（图1-B、C）。

3 结论与讨论

三七根腐病病原菌主要是病原真菌、线虫和假单胞菌[17]。其发病机制较为复杂，发病植株症状最为明显，主要表现为6 种：黄腐型、干裂型、髓烂型、湿腐型、茎基干枯型、急性青枯型[18]。作为一种土传性病害，其常年的发病率在5%～20%，严重时可达70%甚至出现绝产的情况[19]，春秋季为发病高峰期[20]。

目前对于三七的研究仍主要集中在药理方面，对于其病害防治暂无突破性进展。本试验通过生长速率法，从9 种植物提取物中筛选出具有抑菌效果的苦楝子，发现作用96 h 后，在质量浓度为2 mg/mL下，对三七根腐病病原菌的抑制率为100%，EC50为0.60 mg/mL，并通过对菌丝形态的观察，证实苦楝子提取物对该病原菌具有良好的抑菌活性。苦楝子提取物对菌丝的影响可能是由于逆境刺激而产生厚垣孢子和短小分枝，阻碍病原菌的生殖生长和营养生长，降低孢子产量，以达到抑菌的目的。

绿色天然的植物源杀菌剂是既对病原菌有抑菌效果，同时又能够提高寄主的免疫力。近年来，国内外对植物源杀菌剂进行了大量研究，主要还是集中在离体环境下抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发[21]。也有研究者发现，植物精油能够破坏真菌生物膜系统，从而降低其稳定性，导致细胞内环境紊乱[22]。陈楚英等[23]采用牛津杯法验证了白薇醇提物能够使意大利青霉菌菌丝膨大、畸形，高浓度下可使菌丝断裂、内含物消解，从而达到抑制菌丝生长的效果。本研究结果表明，苦楝子提取物能使三七根腐病病原菌菌丝膨大，出现短小且缢缩分枝。有关苦楝子提取物能否诱导三七植株防御性酶活性的提高以及抑制三七根腐病病原菌菌丝生长的分子机制还有待进一步研究。