吴博泽，刘 璇，郭俊佩，许冬梅，袁建琴，高建华，史宗勇

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

2018 年全球转基因作物种植面积1.917 亿hm2，其中，转基因玉米约占30%[1]。转基因生物技术诞生以来，生物安全问题相伴而生，不同国家和地区采取各具特色的转基因生物安全管理制度，以确保人类、植物、动物、微生物和生态环境安全[2]。我国采取积极的应对措施，制订了一系列法律法规对其进行严格管理。为实现有效监管，必须对相应的转基因生物及其产品建立精准检测方法。目前，转基因产品检测方法主要集中在核酸检测和蛋白质检测2 个方面[3]。其中，核酸检测主要针对外源插入序列中的特殊元件或者插入序列附近的特征序列。通常，转化体特异性检测的靶标主要是外源插入序列与靶标物质基因组连接区域的DNA 序列。这种方法具有高度的专一性，是转化体特异性检测的首选方法[4]。

在众多转基因作物中，耐除草剂性状的转化体推广面积最广，比如，2018 年，耐除草剂性状转基因作物约占全球转基因作物推广面积的46%。目前主要的耐除草剂基因是epsps 和bar。耐除草剂玉米MON87427 是孟山都公司研发的耐草甘膦的转基因品系，插入的外源序列包含一个根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens CP4）epsps 基因的表达框[5]。该基因编码一种5- 烯醇式丙酮酰- 莽草酸-3- 磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synt hase，EPSPS），该酶对除草剂草甘膦表现出极高的耐受性，常被用作转基因耐草甘膦性状的筛选标记[6-9]。在MON87427 中，该基因由花椰菜花叶病毒CaMV 35S 启动子和NOS 终止子调控表达。

据农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）统计，MON87427 在全球18 个国家已授权食用或饲用，在美国、加拿大等4 个国家已授权批准种植。目前，我国也已经批准该转化体产品的进口。因此，对该转化体在进口过程中的检验检测和进入国内市场后的监督管理显得尤为重要和迫切。

本研究以耐除草剂玉米MON87427 转化体特异性序列为依据，建立转化体特异性定性PCR 检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行测试，旨在为对该转化体的安全评价、行政监管提供重要的技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

耐除草剂玉米MON87427、耐除草剂玉米MON87427 受体材料由孟山都公司研发，由农业农村部科技发展中心提供相应的籽粒粉末。

其他转基因玉米混合样品，包含Bt176、Bt11、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON88017 和MON810 等12 种转基因玉米，每种转基因玉米质量分数为1%；转基因大豆混合样品，包含305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2、305423×GTS40-3-2 等7 种转基因大豆，每种转基因大豆质量分数为1%；转基因棉花混合样品包含LLCOTTON25、MON531、MON1445、MON15985 和MON88913 等5 种转基因棉花，每种转基因棉花质量分数为1%；转基因油菜混合样品，包含MS1、MS8、GT73、RF1、RF2、RF3、T45、Topas19/2 和Oxy235 等9 种转基因油菜，每种转基因油菜质量分数为1%；转基因水稻混合样品，包含TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1 等7 种转基因水稻，每种转基因水稻质量分数为1%。非转基因玉米样品为大丰30。这些材料均为籽粒粉末，由农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心（太原）提供。

1.2 试剂

本研究使用的主要分子生物学试剂为Taq DNA 聚合酶及其配套试剂，包括buffer、dNTPs 等，还有核酸标准分子量DL2000 DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司）；其他生化试剂包括CTAB、Tris、EDTA、琼脂糖和无机盐等（北京言必信科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与筛选 使用Primer 5.0 软件，根据耐除草剂玉米MON87427 的T-DNA 序列插入位点5′端旁侧序列设计8 条引物（正反各4 条），共16对引物组合（表1）。

采用16 对引物组合，每个组合设置2 个平行，按农业部1485 号公告-4-2010 规定[10]，提取质量分数1%的MON87427 基因组DNA，检测DNA 质量和浓度，并将DNA 稀释到50 ng/μL 备用。

采用25 μL PCR 扩增体系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25.0 mmol/L MgCl21.5 μL，各2.5 mmol/LdNTPs2.0 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，1 U/μL Taq DNA 聚合酶1 μL，加ddH2O 至总反应体积25 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35 次循环；72 ℃延伸7 min。

表1 设计引物信息

1.3.2 退火温度和引物浓度优化 针对MON87427玉米候选引物，选择56、58、60、62、64 ℃共5 个退火温度和0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 等4 个引物浓度，对PCR 反应条件和反应体系进行优化。

1.3.3 特异性和灵敏度测试 为测试本研究建立的检测方法特异性，设置空白对照；阴性对照，质量分数为1%的MON87427 受体玉米；阳性对照，质量分数为1%的MON87427 玉米；利用筛选出来的候选引物，对1.1 中其他转基因玉米混合样品、转基因大豆混合样品、转基因水稻混合样品、转基因棉花混合样品、转基因油菜混合样品、非转基因玉米样品进行PCR 检测，确定该引物的特异性。

将MON87427 玉米与对应的非转基因受体玉米按质量比混合制成MON87427 质量分数分别为10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的混合样品，用以确定检测方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

对16 对引物组合进行初筛，结果显示，FA/RA（446 bp）、FA/RB（503 bp）、FA/RC（543 bp）、FA/RD（554 bp）、FB/RC（406 bp）和FB/RD（417 bp）组合扩增结果较为理想，可作为候选引物，进一步优化和筛选（图1）。

使用上述6 个引物组合，对不同质量分数的MON87427 玉米DNA 进行PCR 扩增，结果显示，引物组合FA/RC 的特异性和灵敏度均优于其他组合（图2）。因此，本研究将对该引物组合进行PCR 反应条件和体系的优化。

2.2 退火温度和引物浓度优化结果

对引物组合FA/RC 进行退火温度和引物浓度 优化，结果表明，转基因MON87427 玉米成分在设定条件下（引物浓度0 μmol/L 除外）均有预期扩增，但不同条件对转基因的扩增效果存在差别，其中，0.4 μmol/L 引物浓度、58 ℃退火温度扩增的效果最佳（图3），以此初步建立了耐除草剂玉米MON87427转化体特异性检测方法。

2.3 特异性测试结果

对建立的MON87427 玉米普通PCR 定性检测方法进行特异性测试。结果显示，仅从质量分数1%的MON87427 玉米混合物样品中扩增出预期DNA条带，而在其他样品中均未扩增出相应条带（图4）。结果表明，建立的MON87427 玉米检测方法具有高度特异性。另外，该方法能够在MON87427 玉米质量分数≥0.05%的混合样品中稳定扩增出预期DNA 片段，表明该方法具有较高的灵敏度且重现性良好（图5）。

3 结论与讨论

本研究建立了MON87427 玉米转化体特异性的定性PCR 检测方法，该方法涉及的技术参数符合我国转基因生物安全管理通用技术要求，能够高效、精准检测转基因抗虫耐除草剂玉米MON87427，具有广泛的实用性和良好的应用前景。

随着转基因技术的发展，全球转基因作物种植面积持续增长，公众对转基因生物安全性日益关注。相应转基因作物的研发也迅速带动发展转基因作物检测方法的研发，对农业转基因生物及其产品实行安全评价、产品标识、生产许可、经营许可、进口许可、加工许可等制度的实施提供了重要技术支撑[10-12]。

转基因玉米成分检测对于玉米品种鉴定和对转基因产品进行有效规范管理具有重要的现实意义[13]。在转基因产品检测过程中，PCR 技术因其特异性强、灵敏度高、重现性好，检测成本较低的特性应用最为广泛[14-17]。其中，转化体特异性PCR 检测方法以转基因作物的旁侧序列（与外源插入片段连接的受体基因组序列）与外源插入片段的连接即转化体特异序列为检测靶标，具有较高的特异性，是转基因产品检测国际通用方法之一[18]。