刘松奇 戢得蓉 段丽丽

(四川旅游学院，四川 成都 610100)

百香果，又名西番莲，原产于热带非洲，其果籽含有丰富的油脂及其他功能性成分。已有对百香果种籽中总黄酮的体内抗氧化活性的研究发现其抗氧化性效果显著，百香果籽油可以作为开发保健型食品的备选材料。利用百香果籽含油量高的特点，选择合适的方式提取其油脂，是目前对百香果籽研究的一大热点。

目前常见的从种籽中提取油脂的方法有传统压榨法、索氏提取法、超声波(微波)辅助提取法[1-2]、水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳提取法[3]、冷压法结合固相微萃取分离法等[4]。比较压榨法、浸出法、超临界法、水代法及水酶法提取茶油发现水酶法及水代法提取的油脂品质均优于其他方法[5]。与溶剂法、压榨法相比，水酶法不会改变油脂的脂肪酸组成，毛油质量更有利于后续精炼工艺的指标特征，与水剂法相比，水酶法可以提高油脂VE的含量与氧化稳定性[6]。水酶法相对于其他方法，具有安全、绿色、高效的特点，同时具有条件温和、能耗较低、污染少、废物易处理等优点，所提取的油脂品质也较高。

本研究采用水酶法提取百香果籽油，利用混料实验设计优化复合酶的配比、响应面实验优化提取工艺、DPPH法初步评价此方法所提百香果籽油的抗氧化性。将百香果籽油脂进行提取，既丰富了百香果籽的应用，又丰富了油脂的选择。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

百香果紫果：湖南邵阳市；山核桃油：辽宁晟麦实业股份有限公司；橄榄油：哈尔滨普润油脂有限公司；酸性蛋白酶、糖化酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶及葡聚糖酶：河南庆飞食品配料有限公司；氢氧化钾、异丙醇、无水乙醚、无水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、酚酞、碱蓝6B、冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、重铬酸钾、正己烷、盐酸分析纯、DPPH：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

Scout SE型电子天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司；DFY-400摇摆式粉碎机：温岭市大德药机有限公司；H2050R型台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；101-0A型电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；STARTER 3100型pH计：奥豪斯仪器(上海)有限公司；UV BlueStar A紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺

将干燥的百香果籽于105℃烘干至恒重，后用高速粉碎机进行破壁粉碎并混合均匀，称量10g粉碎后的百香果籽，加入一定量的水，混合均匀后调节pH，添加酶后摇匀，酶解一段时间后，将酶解容器置于90℃灭酶20min，然后冷却至室温后置于-18℃冻藏20h，冻藏结束后置于40℃解冻2h，解冻后离心(9000r/min,20min)后吸取上层清油，低温烘干至质量恒定，计算百香果籽油提油率。

1.2.2 提油率的计算

百香果籽油提取率：

w(%)=[m2/(m1×B)]×100%

(1)

式(1)中：B为百香果籽的总脂肪量/%，m1为称取粉碎后百香果籽总质量/g，m2为提取得到百香果籽油的质量/g。

1.2.3 酶种类的筛选

百香果籽细胞壁主要是粗纤维构成，而水酶法主要是通过酶破坏油脂与蛋白质(糖类)结合形成的复合物来达到释放油脂，提高提油率的目的。考察8种酶(最适pH值，最适温度/℃)：果胶酶(3.5，50℃)，糖化酶(4.0～4.5，60℃～62℃)，酸性蛋白酶(3.0，40℃)，中性蛋白酶(6.9，48℃)，碱性蛋白酶(8.0，50℃)，纤维素酶(4.8，50℃)，木瓜蛋白酶(6.5，60℃)及葡聚糖酶(4.2，60℃)对百香果籽油提油率的影响。分别在所选8种酶的最适pH值、最适宜温度条件下，以相同的料液比(1∶3)、酶用量(2%)酶解相同的时间(6h)进行提取，计算不同酶酶解后的百香果籽油的提取率。

1.2.4 单因素实验

其他条件相同的前提下，分别探讨pH值(4.5、5、5.5、6、6.5)，酶解温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)，酶制剂用量(1%、2%、3%、4%、5%)，酶解时间(3h、4h、5h、6h、7h)，料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)5个因素对提油率的影响。

1.2.5 混料实验优化分析

采用Design Expert10.0.4设计混料实验，以葡聚糖酶添加比例(A)、木瓜蛋白酶添加比例(B)、糖化酶添加比例(C)为自变量，百香果籽油提油率为响应值，并把3种酶的添加比均限定在(0.1～0.8)且A+B+C=1(100%)。

1.2.6 响应面优化分析

根据Box-Behnken实验设计原理，以百香果籽提油率为响应值，选取酶制剂用量、酶解温度、pH值这三个因素进行响应面优化实验[7]。响应面实验因素与水平表见表1。

表1 响应面实验因素与水平

1.2.7 理化指标测定

粗脂肪测定参考NY/T 4-1982《谷类、油料作物种子粗脂肪测定》；酸价测定参考GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》；过氧化值测定参考GB 5009.227-2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》；皂化值参考GB/T 5534-2008《动植物油脂 皂化值的测定》；油脂质量评价参考GB 2716-2018《食品安全国家标准 植物油》。

紫外测定：将百香果籽油配制成1g/100ml正己烷溶液，于270nm～900nm波长处测其紫外吸收光谱。

1.2.8 DPPH自由基清除率的测定

用无水乙醇配制0.10mmol/L DPPH溶液，用乙酸乙酯配制不同浓度的样品液(5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL),在比色皿中分别加入试剂与样品液，混匀后于517nm波长测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率：

S(%)=[C-(A-B)]/C

(2)

式(2)中：A为2mL DPPH溶液+2mL样品液，B为2mL无水乙醇+2mL样品液，C为2mL DPPH溶液+2mL样品溶剂。

1.3 实验数据与处理

所有实验平行三次及以上，数据采用Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 酶的种类对提油率的影响

选取8种酶进行实验，所得结果如图1，提油率最好的3种酶制剂是碱性蛋白酶、酸性蛋白酶以及木瓜蛋白酶。但是碱性蛋白酶与酸性蛋白酶分别在偏强碱和偏强酸条件才能体现其活力，而油脂在强酸和强碱条件下遇较高温度会较快水解，不利于油脂的稳定性[8]。结合实验结果及酶的专一性，使用复合酶提取油脂，总提取率会稍高，同时为节约成本，选取pH以及酶解温度相近的酶进行复配，利用混合酶提高提油率，所以将木瓜蛋白酶、糖化酶及葡聚糖酶进行复配，初步采用添加比例为1∶1∶1。

图1 不同酶作用下百香果籽油的提油率

2.2 单因素实验结果

2.2.1 pH对提油率的影响

在60℃酶解温度、酶制剂(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量为3.5%、料液比为1∶3条件下酶解6h，研究不同pH条件对提油率的影响，结果如图2。pH对百香果籽油的提取有显著影响，提油率随着酶解pH的升高先增加后减小，在pH为5.5时达到38%。这可能与复合酶的最适酶解pH值有关，pH的改变影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而降低酶与原料的结合力，降低油脂的释放。

图2 不同pH作用下百香果籽油的提油率

2.2.2 温度对提油率的影响

在相同的pH值为5.5、酶制剂(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量为3.5%、料液比为1∶3条件下酶解6h，考察温度的改变对提油率的影响，结果如图3。温度由45℃升到55℃时，提油率迅速上升，在55℃提油率达到最高。温度上升提油率下降是由于一般情况下环境温度每升高10℃，酶解速度就增快一倍左右[9]，直到酶解速度达到相对最大值，后期温度继续升高，蛋白质逐渐发生变性，导致酶失去活性，提油率逐渐降低。

图3 不同温度作用下百香果籽油的提油率

2.2.3 酶制剂用量对提油率的影响

在pH值为5.5、酶解温度为55℃、料液比为1∶3条件下酶解6h，考察酶制剂(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量对提油率的影响，结果如图4。酶制剂添加量从1%增加到4%的这个过程中，提油率逐步提高。但是超过4%之后，提油率开始出现下降现象，这可能是因为酶的竞争性抑制作用降低酶解的效率。

图4 不同酶制剂用量百香果籽油的提油率

2.2.4 料液比用量对提油率的影响

在pH值为5.5、酶解温度为55℃、酶制剂(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量为4%条件下酶解6h，考察料液比对提油率的影响，结果如图5。当料液比在从1∶2到1∶3，提油率迅速提高，可能是因为随着水分的增加，增大了酶与底物的扩散，使两者充分接触，然而1∶3之后提油率开始下降，可能因为大量水分降低了酶与底物的浓度，使两者的碰撞率下降，从而降低提油率。

2.2.5 酶解时间对提油率的影响

在pH值为5.5、酶解温度为55℃、料液比为1∶3、酶制剂(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量为4%条件下考察酶解时间对提油率的影响，结果如图6所示。随着反应时间的增加提油率也逐渐增加，反应时间达到6h时得到最大提油率，随后渐渐稳定，由此可推测时间的增加，底物浓度逐渐减少，当达到6h时酶解基本结束，考虑到能源消耗问题选择6h为宜。

图6 不同酶解时间下百香果籽油的提油率

2.3 酶解法提取百香果籽油的混料实验结果

在单因素实验结果下，以葡聚糖酶添加比例(A)、木瓜蛋白酶添加比例(B)、糖化酶添加比例(C)为特征值，提油率为响应值，进行混料实验，结果如表2。

表2 混料实验结果

利用Design Expert 10.0.4软件，对表2中的数据进行回归拟合，得到提油率与葡聚糖酶(A)、木瓜蛋白酶(B)、糖化酶(C)的多元线性回归方程：提油率=+31.49A+40.78B+35.74C-37.28AB-7.32AC+4.1BC-28.6ABC+116.75AB(A-B)-66.7AC(A-C)+0BC(B-C)。对以上回归模型进行方差分析，详见表3。

回归方程中由F分布来检验响应面的显著性，概率P值越小，对应自变量显著性越好。由表3得出，提油率模型总回归项为显著(P=0.016 5<0.05)，失拟性不显著(P=0.424 0>0.05)说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，即该回归模型拟合度好，实验误差比较小。校正决定系数Adj.R2是0.816 0，表示模型拟合较好。CV值是6.59%，说明该回归模型的数据精确度较高。性噪比AP为7.912大于4，说明模型的可行度比较高。决定系数R2为0.929 2，说明二次项模型中估测值与实验真实值之间的相关性可达92.92%。

表3 混料实验方差分析结果

注：P<0.05表示差异显著，标注为*；P<0.01表示差异极显著标注为**。

复合酶的配比对提油率交互影响的三维图、等高线图形如图7。当葡聚糖酶用量较多，木瓜蛋白酶与糖化酶用量较少时，提油率在30%左右。而当木瓜蛋白酶或糖化酶用量较多，另外两种酶用量较少时，提油率均能达到40%。3种酶在酶解过程中，木瓜蛋白酶与糖化酶均能起到主导作用，同时三维图的曲面说明酶与酶之间有交互作用，3种酶适宜的配比混合后产生协同作用显著提高提油率。最佳配比为木瓜蛋白酶∶葡聚糖酶∶糖化酶=0.8∶0.1∶0.1。

2.4 酶解法提取百香果籽油的响应面实验结果

以pH(A)、温度(B)、酶制剂用量(C)等影响因素为特征值，响应值为提油率，进行三因素三水平的响应面分析，实验结果如表4。

表4 响应面实验结果

利用Design Expert 10.0.4软件，对表4中的数据进行回归拟合，得到提油率与酶解pH值(A)、酶解温度(B)、酶制剂用量(C)的多元线性回归方程：提油率=+48.90+6.00A+3.13B-1.50C-6.63AB+8.88AC-3.88BC-2.89A2-2.14B2-5.89C2。对以上回归模型进行方差分析，详见表5。

表5 响应面实验方差分析结果

注：P<0.05表示差异显著，标注为*；P<0.01表示差异极显著标注为**。

由表5可知，校正决定系数Adj.R2是0.880 8，预测复相关系数Pred.R2为0.761 3说明模型拟合较好。性噪比AP为12.884大于4，说明模型的可行度比较高。决定系数R2为0.947 8，说明二次项模型中估测值与实验真实值之间的相关性可达94.78%。

各因素交互作用对百香果籽油提油率的影响见图8，酶用量与温度的交互作用对百香果籽油的提油率影响显著，酶解温度与pH值、酶制剂用量与pH值的交互作用对百香果籽油的提油率影响极显著。酶解温度在50℃、酶制剂用量为4.96%、pH=6时提油率最高，可达58.75%。在最优条件下，进行平行三次实验。结果分别为57.00%、56.96%、59.02%，提油率平均分值与预测值相对偏差小于5%，测定结果稳定，实验结果可靠，说明回归方程具有较高的准确性。

图8 各因素交互作用对百香果籽油提油率的影响

2.5 DPPH自由基清除率实验结果

图9 油脂的DPPH自由基清除率

百香果籽油对DPPH自由基清除率结果见图9，百香果籽油在实验范围内对DPPH自由基有一定的清除作用，清除能力随着油脂浓度的增加而增强，最大清除率可达到78.6%。与橄榄油及山核桃油这两种优质食用油相比，结果表明清除能力相近，体外抗氧化活性较强。整体可以看出水酶法提取的百香果籽油的DPPH自由基清除率效果较好。

2.6 理化指标测定

对所选品种的百香果籽进行油脂含量实验，其粗脂肪含量为20%。通过最佳工艺条件，所提取的油脂呈淡黄色，透明度好，无异味略带百香果芳香味。百香果籽油酸价不大于4.0mg KOH/g，过氧化值不大于0.25g/100g，由表6可知，水酶法提取的百香果籽油均符合国家标准。对水酶法所提取的百香果籽油在270nm～350nm范围内紫外吸收较强，表明其有一定的防护作用，百香果香气成分丰富，其油也有一定的香味，可用于化妆品中的防晒产品与香水产品。

表6 百香果籽油理化指标结果

3 结论

为了提高百香果籽油的提油率，对单一酶及复合酶的种类进行了筛选，确定了木瓜蛋白酶、糖化酶及葡聚糖酶为研究对象的提取工艺。经混料实验优化后，确定木瓜蛋白酶、葡聚糖酶与糖化酶的最佳配比为8∶1∶1。通过单因素实验得出，酶解温度为50℃～60℃、酶制剂用量为3%～5%、pH值为5～6，作为响应面实验范围。通过响应面实验确定提取百香果籽油的最佳工艺为：酶解温度为50℃、酶制剂用量为4.96%、pH值为6、时间6h、料液比1∶3。在此条件下提油率可达58.75%，提取的百香果籽油色泽良好、透明度好、气味芬芳无异味。对百香果籽油的紫外测定发现其在270nm～350nm紫外吸收较强，水酶法方式提取的百香果籽油DPPH清除能力较好。