外泌体相关跨膜蛋白上调整合素促进肝细胞癌中细胞迁移的研究

2020-04-16阚宠黎建昌黄小程陈福禹方东傅后杰卢东军陈耀林倪安妮李根亮

右江医学 2020年3期

阚宠　黎建昌　黄小程　陈福禹　方东　傅后杰　卢东军　陈耀林　倪安妮　李根亮

【摘要】目的探讨外泌体相关跨膜蛋白基因在肝细胞癌（HCC）中的作用及可能的作用机制。方法以癌症来源外泌体相关跨膜蛋白基因为背景，以模型小鼠HCC组织和健康肝组织为材料，以RNA-seq和生物信息学作为分析手段进行研究。结果于HCC中发现138个差异表达的外泌体跨膜蛋白基因，它们共参与11个生物学程序、28个细胞组分、9个分子功能、1个信号通路和5个编码蛋白序列特征。进一步分析发现，这些基因编码的蛋白多数含有拓扑结构域，主要参与细胞迁移、整合素信号通路、细胞粘连及癌症蛋白聚糖信号通路，而且一些外泌体来源跨膜蛋白还具有蛋白结合、钙离子结合及转移酶活性等分子功能。结论 HCC中外泌体相关跨膜蛋白主要在细胞膜表面通过上调整合素和癌症蛋白聚糖途径，以蛋白结合、钙离子结合及转移酶活性等分子功能影响细胞粘连，促进HCC中的细胞迁移。

【关键词】肝细胞癌;外泌体;跨膜蛋白;整合素;细胞迁移

中图分类号：R735.7 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.03.006

Downregulation of exosome-associated transmembrane proteins inhibits liver cancer cell migration

KAN Chong1，LI Jianchang1，HUANG Xiaocheng1，CHEN Fuyu1，FANG Dong1，FU Houjie1，LU Dongjun1，CHEN Yaolin2，NI Anni3，LI Genliang4

（Youjiang Medical University for Nationalities 1.2016 Undergraduate in Clinical Medicine，2.2015 Undergraduate in Clinical Medicine，3.Graduate School，4.Department of Biochemistry and Cell Molecular Biology，School of Basic Medical Sciences，Baise 533000，Guangxi China）

【Abstract】Objective The purpose of this study was to investigate the role of exosome related transmembrane protein genes in hepatocellular carcinoma （HCC） and the possible mechanism.Methods The background of cancer derived exosomes related transmembrane protein genes was studied.HCC tissues from mouse model and healthy liver were used as materials.And RNA-seq and bioinformatics were used as analytical methods.Results There were 138 differentially expressed transmembrane protein genes in HCC.These genes participated in 11 biological processes;formed 28 cell components，9 molecular functions，1 KEGG pathway and 5 UP_seq feature.Further analysis showed that most of the proteins encoded by these genes contain topological domains，which were mainly involved in cell migration，integrin signaling pathways，cell adhesions and proteoglycan signaling pathways in cancer，and some exosomal transmembrane proteins had protein binding，calcium ion binding，and transferase activity.Conclusion Exosome related transmembrane proteins in HCC mainly regulate the syntaxin and cancer proteoglycan pathways on the surface of cell membrane.The molecular functions of protein binding，calcium binding and transferase activity affect cell adhesion and promote cell migration in HCC.

【Key words】hepatocellular carcinoma;exosomes;transmembrane proteins;integrin;cell migration

1983年，約翰斯通初次在绵羊的网织红细胞上发现了外泌体。它可由不同细胞产生并释放[1]。并且经由细胞分泌的外泌体含有不同的生物学功能，如增殖分化、细胞迁移、介导细胞间物质传递及交流等。肿瘤细胞分泌的外泌体可促进癌症的侵袭和转移[2]，但也有的能够抑制肿瘤的生长发育[3]。外泌体内也存在一些相关跨膜蛋白，它们也能够影响肿瘤细胞的黏附、分化、迁移及侵袭[4～5]。但肿瘤来源的外泌体相关跨膜蛋白参与完成这些功能的机制还有待进一步研究。本研究以实验室前期构建的肝细胞癌（HCC）模型小鼠的瘤体组织和健康对照小鼠的肝组织进行RNA-seq，从NCBI数据库中下载肿瘤来源外泌体相关跨膜蛋白基因，构建比对数据库，应用生物信息学手段，筛选瘤体组织中差异表达的外泌体相关跨膜蛋白基因，再通过功能富集获得外泌体相关跨膜蛋白基因（exosome-associated transmembrane proteins-encoding genes，ETPGs）在癌组织中的作用，探讨ETPGs在HCC中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 肝癌小鼠模型的构建和RNA-seq

7周龄健康昆明小鼠100只购自右江民族医学院动物实验中心。参照前期实验的方法[6]，50只通过双前肢腋下注射H22肝癌细胞株构建肝细胞癌小鼠模型，另50只同法注射不含H22的生理盐水作对照。正常饲养4周后，取瘤体组织和对照组小鼠肝组织，以RNA提取试剂盒（Invitrogen，中国上海）提取总RNA（n=50），同组内总RNA样本等量混合用于RNA-seq[6]。生物信息学分析HCC中的差异表达基因，基因表达以每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，FPKM）表示。

1.2 ETPGs的筛选

从NCBI的nucleotide数据库下载癌症来源的外泌体相关跨膜蛋白基因，构建基因比对数据库。以差异表达基因与构建的基因比对数据库进行比对，获得HCC中差异表达的ETPGs（differentially expressed ETPGs，DEEs）。其中以FPKM比值≥2或≤0.5，且错误发现率（false discovery rate，FDR）≤0.05的基因为DEEs。

1.3 DEEs的功能分析

通过DAVID在线软件（https：//david.ncifcrf.gov），对以上获得的DEEs进行功能富集，对富集到的各功能进行功能注释聚类，其中以FDR≤0.05的为有统计学意义。

1.4 DEEs编码蛋白的互作分析

通过STRING 11.0版本软件（https：//string-db.org/）在线对DEEs编码蛋白进行互作分析，以此评价HCC中DEEs编码蛋白在分布和功能上的相关性。

2 结果

2.1 筛选出的DEEs

通过比对分析，我们共筛选出138个DEEs。见表1。

2.2 筛选出的DEEs的功能

对筛选出的DEEs经功能富集分析，结果显示共富集到11个生物学程序（biological process，BP）、28个细胞组分（cellular component，CC）、9个分子功能（molecular function，MF）、1个信号通路（KEGG pathway，KP）和5个编码蛋白序列特征（UP_seq feature，US），见图2、图3。从28个CC可以看出，大量跨膜蛋白相关基因编码蛋白分布于胞膜区域和细胞连接部分。而从11个BP可以看出，这些基因编码跨膜蛋白参与的生物学过程，是细胞粘连（14个基因）、整合素信号通路（6个基因）、细胞迁移调控（7个基因）等。9个MF显示这些基因编码蛋白主要具有蛋白结合、钙离子结合及转移酶活性等功能。1条信号通路则是癌症中的蛋白聚糖信号途径（8个基因）。HCC中相关基因编码蛋白的互作见图4。

3 讨论

研究证实，跨膜蛋白在肿瘤的侵袭与转移中扮演重要角色[7]。我们通过对HCC中DEEs的分析，发现在HCC中存在138个相关差异表达基因。功能富集结果显示，这些DEEs共参与11个BP、28个CC、9个MF、1个KP和5个US。它们的生理功能主要集中在细胞迁移的调控、整合素信号通路和细胞粘连，在细胞连接和细胞膜处发挥作用。

整合素家族作为细胞黏附分子中的一类，是连接细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相互作用的一种细胞表面糖蛋白受体，在肝癌黏附转移过程中发挥着关键作用[8]。整合素可以介导低剪切力以诱导肝癌细胞的迁移[9]，而IL-8可上调整合素α亚基的表达，但各亚基具有浓度性差异，其调控作用可能具有差异性，但确实可以促进癌细胞迁移[10]。反义整合素αV、β3基因治疗对肿瘤的生长有明显的抑制作用，联合应用整合素αVβ3反义基因治疗对肿瘤生长的抑制作用更为显著[11]，在Hep3B细胞中消减整合素α7（ITGA7）的表达，能明显抑制细胞克隆形成和细胞迁移[12]。整合素表达的减少有可能抑制肝癌的发生、发展[13]。我们的研究结果表明，整合素在参与肝癌的发生发展等过程中，可能能够通过上调表达来促进肿瘤迁移。在我们的研究中，外泌体相关跨膜蛋白基因中也出现了四跨膜蛋白家族等跨膜蛋白基因。整合素和生长因子、蛋白酶等可组成跨膜蛋白网络，调节细胞信号转导、细胞黏附、迁移、增殖、分化等生理过程[14～15]。我们发现，在HCC中，与整合素相关的多种基因表达上调，表明HCC癌组织细胞膜中整合素可能被激活表達，以达到促进肝癌细胞迁移的目的。这些跨膜蛋白具有蛋白结合、钙离子结合及转移酶活性等分子功能，表明其发挥作用主要是通过这些方式实现的。KEGG分析表明，整合素和跨膜蛋白相关基因也参与以上GO功能相关的1个信号通路，即癌症蛋白聚糖信号途径。这些结果表明，在HCC中，多种相关基因出现异常表达，并参与蛋白聚糖信号途径。说明整合素等跨膜蛋白的表达上调通过蛋白聚糖信号途径发挥着极其重要的作用。本研究中差异表达基因的编码蛋白的互作分析同样说明了这些基因功能的相关性。

综上所述，在HCC中共有138个DEEs，其功能主要集中在细胞粘连、整合素信号通路、细胞迁移调控、癌症蛋白聚糖信号通路等方面。HCC中外泌体相关跨膜蛋白可能利用上调整合素，以蛋白结合、钙离子结合及转移酶活性的方式，通过细胞黏附，以癌症中的蛋白聚糖信号途径促进HCC中细胞的迁移。

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（收稿日期：2019-11-27 修回日期：2020-02-06）