曹鑫盛， 黄凯， 路斌， 潘建洲， 曹嘉慧， 张震， 陈成勋*

(1. 广西大学动物科学技术学院，南宁530004； 2. 天津农学院，水产学院，天津300384；3. 天津赞兰科技有限公司，天津300384； 4. 广西防城港东兴市北投集团，广西防城港538100)

黄额闭壳龟Cuoragalbinifrons属地龟科Geoemydidae闭壳龟属，在中国仅分布于广西、海南(周婷，李丕鹏，2013)。相关研究表明，野外生境破碎化日益严重与猖獗的偷猎现象导致黄额闭壳龟野外种群逐渐衰亡(武正军，李义明，2003；汪继超等，2011)。黄额闭壳龟被国际自然保护联盟(IUCN)、中国脊椎动物红色名录列为极危(CR)物种(蒋志刚等，2016；IUCN，2018)，同时被收录入濒危野生动植物国际贸易公约(CITES)附录Ⅱ(曾岩，2011)。

面对野生资源逐渐枯竭的现实，对黄额闭壳龟的繁殖习性进行研究，不仅可以对该物种进行人工繁育，用于补充自然资源，维持野外种群基数，同时还能满足宠物市场的需求，创造经济价值。与野外资源枯竭及市场需求相对应的是目前国内外均无对人工养殖条件下黄额闭壳龟繁殖习性的研究报道，目前有记录的人工孵化个体仅为野生待产种龟在人工暂养时繁殖并人工孵化而来，不能认为已成功对该物种进行人工繁殖。综上所述，对人工养殖条件下黄额闭壳龟的繁殖行为进行研究，为该物种的人工保育及后续产业化发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验对象

于2013年查阅相关资料，拟定研究方法，储备饲养相关工具、材料，并建设试验场所(2014年场地建设完毕)。2014年由广西壮族自治区东兴市专业养殖户刘洪高、潘建洲协助引种黄额闭壳龟亲龟7只，经过2014—2016年的预饲养，并改进、添加相关物资，2017—2019年正式开始对人工繁殖条件下黄额闭壳龟的繁殖行为进行研究。

选择人工隔离饲养2年以上非待产黄额闭壳龟性成熟个体，共7只(5雌2雄)。分别使用150T型电子数显卡尺(Meinaite)、DT2000型电子天平(美国双杰)测定6个可量性状(图1)：腹甲宽(plastron width，PW)、腹甲长(plastron length，PL)、背甲宽(carapace width，CW)、背甲长(carapace length，CL)、体高(carapace height，CH)和体质量(weight，WT)；测定龟卵的5个可量性状：卵长径(L1)、卵短径(L2)、卵壳质量(L3)、卵壳厚(L4)和卵质量(weight of egg，WE)，长度测量值精确至0.01 mm，质量测量值精确至0.01 g。

图1 黄额闭壳龟背甲及腹甲形态指标测量Fig. 1 Measurement of the morphological indexof Cuora galbinifrons

1.体高， 2. 背甲长， 3. 背甲宽， 4. 腹甲宽， 5. 腹甲长

1. carapace height， 2. carapace length， 3. carapace width， 4. plastron width， 5. plastron length

1.2 饲养环境及方式

黄额闭壳龟养殖条件参照曹鑫盛等(2018)饲养繁殖锯缘闭壳龟C.mouhotii的养殖环境进行设置，区别在于通风窗朝向东北，日常光照强度最高为11 000 lx。

黄额闭壳龟与锯缘闭壳龟习性相近，生境与分布地区部分重叠(周婷，李丕鹏，2013)，因此，饵料配方及投喂方式均参考曹鑫盛等(2018)的方法，不同的是在12月转移养殖区至SPX-450BE人工气候培养箱(天津赛得利斯实验分析仪器制造厂)内，参照海南省五指山市(黄额闭壳龟野外生境)控制箱内温湿度，光照时间7～9 h，光照强度250～400 lx。试验中观察到黄额闭壳龟喜好摄食绿化遮阳种植的红薯Ipomoeabatatas，因此每日增加投放新鲜红薯叶片供其采食，该饲养条件下亲龟年均体质量增长率为6.37%，生长状况良好。

1.3 繁殖及孵化

雄性黄额闭壳龟的领地意识极强，经常被观察到相互攻击现象，因此为避免雄性之间的相互争斗造成损伤，同一时间雌性养殖区域仅有1只雄性；而雌性黄额闭壳龟有啮噬同类龟卵的习性，在产卵前也会表现出较强的领地性，因此雌性在产卵前也单独饲养。交配及求偶行为的记录以李敏(2014)和魏玉峰(2015)中的方法为依据，通过H9W 4K高清红外线相机(新佰)对养殖区内黄额闭壳龟进行24 h摄录观察并记录。

黄额闭壳龟龟卵孵化方法参考曹鑫盛等(2018)，不同的是温度设置为27 ℃±0.2 ℃，空气相对湿度为85%±5%。

2 结果

2.1 亲龟的可量性状与繁殖

在试验过程及对其他养殖户的走访过程中发现，黄额闭壳龟交配和繁殖行为的出现，不能仅以亲龟的体质量为参考，还需要参考亲龟的体型。

人工养殖条件下，对初次出现交配、繁殖行为的黄额闭壳龟进行研究(表1)。以其体质量为因变量，背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、体高为自变量，进行多元回归分析：WT=8.92CL+9.81CW+7.77PL-7.80PW-2.56CH-2 164.53(式1)(Multiple R=0.99，R Square=0.98，Adjusted R Square=0.89，标准误差=46.37；n=7)。

表1 黄额闭壳龟亲龟可量性状Table 1 Measurable characteristics of Cuora galbinifrons

2.2 求偶及交配行为

2014—2016年人工养殖条件下，黄额闭壳龟非冬眠期间均可见交配行为，而2018年的交配高峰期为5—6月(占全年交配次数的41.94%)，交配成功率最高峰也在5—6月(50%)(表2)。黄额闭壳龟交配行为多发生在16∶00—18∶00，阴雨天气(空气湿度≥90%)时，交配次数显著上升。雄性黄额闭壳龟在交配高峰期争斗次数显著上升，在水流喷溅刺激下外阴茎易伸出。雌性在交配期食欲上升，且偏爱高蛋白的鲜活饵料(如昆虫、蚯蚓、螯虾等)，遇刺激易发生后足撑地，泄殖孔扩张的行为，在此期间体质量轻微提高。

黄额闭壳龟的交配行为(表3)可在陆地或浅水中进行，交配行为依次为：

表2 2018年黄额闭壳龟交配及雄性争斗行为记录Table 2 Mating behavior and male fight behaviorrecord of Cuora galbinifrons in 2018

雄性：

感受：闻嗅到雌性的气味，轻啮口部发出“咔咔”声，抬头观望、寻找雌性。

接近：看到雌性时，快速爬行接近雌性。

追逐：当雌性逃跑时，以快速爬行的方式追逐，并会从口部呼出大量气体发出“呼呼”声。

嗅探：接近雌性后，会环绕其爬行，并不时闻嗅雌性身躯多处。

爬跨：从后方爬上雌性背部并用前肢爪子紧抓雌性背甲边缘。偶有发生从前端趴背雌性，出现两龟朝向不一的现象。

制服雌性：调整体位，紧抓在雌性背甲边缘，同时伸缩脖子咬啮其头部和颈盾，迫使雌性将头部缩入壳内尾部更多的伸出壳外。同时尾基部紧贴雌性泄殖腔区域，触探雌性泄殖孔。

攻击：当雌性反抗交配时，会攻击性地撕咬雌性的背甲边缘和四肢，易对雌性造成伤害。

交配：制服雌性后，用前肢撑起身体的前半部，此时2只龟身体角度45～50°。同时移动后肢抓住雌性背甲边缘，后伸出阴茎紧勾雌性尾部，并辅助下插入泄殖腔，偶有发生在阴茎插入后雄性向后仰倒。

雌性：

逃离：当雄性朝自己移动或发生接触时或反抗交配后，迅速远离雄性。

反抗交配：当雄性移动到身边或爬到背上时，试图逃跑或攻击性地撕咬雄性，强烈地挣扎、爬行，将雄性甩离，不接受交配。

接受交配：当雄性移动到身边或爬到背上时，保持安静，无逃离或反抗，偶有轻微挣扎(不影响正常的交配行为)，泄殖孔扩张，接受雄性的求偶。

2.3 产卵行为

人工养殖条件下，雌性黄额闭壳龟每年产卵1次，每次1～2枚，全年最大产卵量2枚，产卵高峰期在6—7月，在产卵前1～10 d会表现出明显的食欲下降，但均未发现食物废绝的现象。黄额闭壳龟的2次繁殖间隔积温为197 230～207 955 ℃·h(n=5)，产卵前表现出极强的攻击性，排斥周围的所有同类，产卵时用后腿挖掘3～4 cm的坑穴，埋藏深度为0.5～1 cm(n=5)。产卵行为持续时间为 107～237 min(n=5)，虽未表现出显著的天气倾向性，但表现出了明显的时间倾向性(10∶00—18∶00)。黄额闭壳龟在产卵后当天即摄食，产卵后的1～15 d摄食欲望显著增加，攻击性增加的现象消失。

表3 黄额闭壳龟求偶交配行为的持续时间Table 3 Courtship and mating duration ofCuora galbinifrons

人工养殖条件下，黄额闭壳龟的产卵行为(表4)完全在陆地进行，产卵过程依次为：

观察：雌性在产卵前伸长颈部四处观望、搜索适宜的产卵区域。优先选择光照强度低(200 lx以下)的松软区域，用前腿挖掘并闻嗅该区域(该过程不会使用后腿挖掘产卵区)。

驱散：雌性停止嗅探，匍匐于产卵区域观察四周，并通过啃咬和撞击将产卵区直径0.5 m内的其他动物，尤其是同类驱离该范围。

营巢：雌性使用后腿在产卵区挖掘出3～4 cm的坑穴，尾部下垂朝向坑穴内准备产卵(此过程中雌性颈部无持续性前伸，泄殖孔未出现扩张)。如受到惊吓，雌性大概率会放弃该产卵区。

产卵：雌性颈部持续前伸，泄殖孔反复收缩、扩张，在巢穴内产出1～2枚龟卵，龟卵表面有黏液，此阶段对外界刺激不敏感。

掩埋：产卵后，雌性泄殖孔收缩，后腿快速挖掘泥土掩埋龟卵，掩埋后雌性常见呆立于原地休憩，体能恢复后离开，试验对象均未表现出护巢习性。

表4 黄额闭壳龟产卵行为的持续时间Table 4 Spawning behavior duration of Cuora galbinifrons

2.4 龟卵形态及孵化

2016年3号、4号黄额闭壳龟分别产出3枚龟卵，其中受精卵2枚，沿用锯缘闭壳龟人工饲养条件下的孵化方法(温度28 ℃±0.2 ℃，相对湿度85%±5%)进行孵化(曹鑫盛等，2018)，发育至37 d时，卵内胚胎全部死亡。参考与黄额闭壳龟野外栖息地重叠的锯缘闭壳龟卵的自然孵化温度(22～28 ℃)(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)，在正式试验时使用恒温27 ℃±0.2 ℃孵化黄额闭壳龟卵。

2017—2019年的正式试验中共获得黄额闭壳龟卵9枚，其中受精卵5枚，平均受精率55.56%(表5)。龟卵为硬壳卵，长径39.78～51.36 mm，短径26.93～31.13 mm，卵质量22.78～32.09 g，卵壳厚0.57～0.63 mm。

共孵化黄额闭壳龟稚龟3只，总孵化率60.00%，孵化周期为118～136 d，孵化积温为76 464～88 128 ℃·h，1日龄稚龟体质量为17.92～21.46 g(表6)。1日龄稚龟背甲长57.14～62.21 mm，背甲宽36.67～38.69 mm(图2)。

表5 黄额闭壳龟产卵与孵化情况Table 5 Circumstances of the eggs and incubationof Cuora galbinifrons

表6 黄额闭壳龟受精卵孵化数据Table 6 Eggs incubation data of Cuora galbinifrons

3 讨论

3.1 人工养殖条件下黄额闭壳龟可量性状应用

本地林业局曾向笔者提出“近年来常有走私者使用‘野生动物驯养繁殖许可证’作为掩护，有关部门对查获的黄额闭壳龟是否为野生个体进行判别时存在较高的难度”相关问题。本试验阶段对越南分布的黄额闭壳龟进行野外调查，共测量、记录野生性成熟黄额闭壳龟个体12只，代入式1计算。野生黄额闭壳龟的实际W值均小于计算结果，且差异有高度统计学意义(P<0.01)。这或许与野生动物在人工圈养后食物的充裕、营养充足以及运动消耗量降低，会在养殖初期内出现体质量显著增长后逐渐趋于平稳的过程(马泽芳，2004)有关。

图2 黄额闭壳龟卵及稚龟形态Fig. 2 The morphological characteristics ofCuora galbinifrons’s eggs and juveniles

a、b. 龟卵； c. 破壳中的稚龟； d. 1日龄的稚龟

a， b. eggs； c. turtles that are hatching； d. 1-day old turtle

试验中发现，当黄额闭壳龟在消化道感染变形虫、细菌性肠炎等疾病时，也会出现短时间内体质量显著降低的现象。而雌性在产卵前则会出现短时间内体质量显著上升的现象。其可量性状回归方程或可用于对成熟亲龟健康状况和发育状况的判定。但本试验样本数较少，后续将对更多不同性别、生长阶段的个体可量性状进行更深入的研究，为人工养殖条件下黄额闭壳龟健康状况、生长及营养状况的判定提供参考。

3.2 黄额闭壳龟卵受精率与孵化

相关研究表明，动物的受精率(受孕率)受到交配温度(陈绍孟等，2012)和交配频率(高富友，2008)的影响，过高的温度和交配频率将使动物的受精率(受孕率)降低。在试验结果中，人工养殖条件下黄额闭壳龟卵受精率仅为55.56%，显著低于人工养殖条件下其他闭壳龟类的受精率(李贵生，唐大由，2002；杨治国，2005；曹鑫盛等，2018)。结合野外种群分布数据(汪继超等，2011)与温度数据(Fischeretal.，2010；李敏，2014)，分析其野外相遇、交配概率、交配温度，为获得更高的龟卵受精率，或可适当降低黄额闭壳龟交配强度及养殖环境温度。

同时针对黄额闭壳龟孵化率不理想的现象，我们了解到黄额闭壳龟产地海南吊罗山保护区，龟卵孵化期营巢地温度为18.5～24 ℃，平均温度20.7 ℃，温度波动5.5 ℃(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)。该孵化温度区间与其他同属龟类的孵化条件(22～28 ℃)差异较大(李贵生，唐大由，2002；杨治国，2005)，试验中未敢贸然采用该温度。因此，黄额闭壳龟受精卵的最适发育温度也将是后续研究的方向。

本试验在参照黄额闭壳龟的人工养殖方法的基础上，首次于全人工条件下连续3年成功繁殖、孵化出子一代个体，平均受精率、孵化率分别为55.56%、60.00%。虽然成功突破了黄额闭壳龟的繁殖方法，但是较低的受精率、孵化率仍是目前制约其人工繁殖、保育的关键因素。后续我们将对黄额闭壳龟受精率、孵化率低下等原因进行深入研究，为这种濒临灭绝动物的保护提供有力的帮助。