朱兰， 俞丹， 刘焕章*

(1. 大连海洋大学，辽宁大连116023； 2. 中国科学院水生生物研究所，水生生物多样性与保护重点实验室，武汉430072)

1 材料与方法

1.1 研究材料

在辽宁省朝阳市朝阳县、朝阳市北票市和锦州市义县的大凌河水系和河南省洛阳市黄河流域的伊河和洛河水系中(图1)中共采集标本170尾，用10%福尔马林固定，分子生物学实验材料取自新鲜标本右侧背部的肌肉组织，保存于75%酒精中，统一保存于中国科学院水生生物研究所。标本的测量使用数显游标卡尺，由同一人对样本的形态学特征进行详细的测量，从标本的左侧进行，精确到0.1 mm，使用SPSS 25.0处理数据，计算平均值和标准差。形态计数和测量方法参照Hubbs和Lagler(2004)，其中，背鳍和臀鳍最后一根在基部的分枝的鳍条计为“1”，侧线鳞的计数是从鳃盖后方第一片有孔鳞数到尾鳍基部最后一片有孔鳞。并且对新种的同属物种进行检视，检视标本为宽鳍：IHB 197607001和197607002，2尾，体长93.3和100.1 mm，日本：琵琶湖，保存于中国科学院水生生物研究所。棘颊：BMNH 1901.3.6.10～1901.3.6.15，6尾，体长 87.2～130.0 mm，全模标本，中国：浙江：甬江，保存于英国自然历史博物馆；IHB 201808102～201808113，12 尾，体长63.4～95.1 mm，中国：浙江：甬江，保存于中国科学院水生生物研究所。

1.2 基因组DNA的提取和PCR扩增、测序

基因组DNA的提取采用高盐浓度抽提法，参照Tang等(2009)的方法，并稍作改动。cytb基因的扩增及测序引物为正向引物L14724(5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’)和反向引物H15915(5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’)(Xiaoetal.，2001)。PCR反应的总体积为30 μL：3 μL DNA模板，反应体系包括：10×Buffer 3 μL，dNTPs 1.5 μL(10 mmol·L-1)，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，Taq DNA聚合酶0.25 μL，加灭菌双蒸水至30 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序公司双向测序，测序引物与PCR扩增引物相同。

图1 中华Zacco sinensis sp. nov.采样点Fig. 1 The sampling sites of Zacco sinensis sp. nov.

1. 辽宁省朝阳市朝阳县柳城街下洼子村(120°37′62″E， 41°48′74″N)； 2. 辽宁省朝阳市北票市章吉营乡章吉营村(120°62′83″E， 41°60′20″N)； 3. 辽宁省锦州市义县九道岭镇四方台村(121°31′58″E， 41°55′19″N)； 4. 河南省洛阳市伊川县河滨街(112°47′39″E， 34°52′55″N)； 5. 河南省洛阳市洛龙区凌波大桥(112°38′57″E， 34°59′91″N)

1. Xiawazi village， Liucheng street， Chaoyang county， Chaoyang city， Liaoning province (120°37′62″E， 41°48′74″N)； 2. Zhangjiying village， Zhangjiying town， Beipiao city， Chaoyang city， Liaoning province (120°62′83″E， 41°60′20″N)； 3. Sifangtai village， Jiudaoling town， Yi county， Jinzhou city， Liaoning province (121°31′58″E， 41°55′19″N)； 4. Hebin street， Yichuan county， Luoyang city， Henan province (112°47′39″E， 34°52′55″N)； 5. Lingbo bridge， Luolong district， Luoyang city， Henan province (112°38′57″E， 34°59′91″N)

1.3 遗传变异与系统发育分析

DNA序列的比对使用Clustal X (Thompsonetal.，1997)，并在SEAVIEW中进行手工校正(Galtieretal.，1996)。采用MEGA 6.0 分析序列中各碱基含量及变异情况(Tamuraetal.，2013)，并基于Kimura双参数(Kimura 2-parameter，K2P)模型计算转换/颠换比率与物种间遗传距离等参数(Kimura，1980；Kondoetal.，2016)。在jModeltest 2 中基于AIC值选择最适碱基替代模型(Darribaetal.，2012)。

马口鱼类系统发育树重建使用邻接法(neighbor-joining，NJ)、贝叶斯法(Bayesian inferences，BI)和最大似然法(maximum likelihood，ML)。邻接法使用MEGA 6.0基于K2P模型，系统树分支置信度采用自引导法(bootstrap analysis)，进行1 000次重复抽样检测。BI树的重建使用MrBayes 3(Huelsenbeck & Ronquist，2001)，替代模型根据筛选结果设定为：nst=6，rates=gamma；起始树设置为随机树，马尔科夫链的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process，MCMC)设置为4条链同时运行4×106代，3条热链1条冷链。每100代对系统树进行抽样，最终得到40 001棵系统发育树，初始的10 000作为老化样本舍弃，剩余的样本构建一致树并计算后验概率。最大似然法分析使用RaxML 8.0(Stamatakis，2014)，替代模型为GRT+I+G，替代数设置为6，设置1 000次自举检验来计算各分支的置信度。

表1 研究所用样本及来源Table 1 Samples and their localities in the present study

注：*新测序列

Note：*sequences in this study

2 结果

正模标本IHB 180407020，雄，体长79.8 mm；2018年4月采自辽宁省朝阳市朝阳县柳城街道下洼子村(大凌河水系)(120°37′62″E，41°48′74″N)；采集人：胡华明、倪述。

副模标本IHB 180407021～180407035，15尾，体长69.3～92.4 mm；2018年4月采自辽宁省锦州市义县九道岭镇四方台村(大凌河水系)(121°31′58″E，41°55′19″N)、辽宁省朝阳市北票市章吉营乡章吉营村(大凌河水系)(120°62′83″E，41°60′20″N)、辽宁省朝阳市朝阳县柳城街道下洼子村(大凌河水系)(120°37′62″E，41°48′74″N)；采集人：胡华明、倪述。

IHB 171101001～171101010，10尾，体长61.1～89.1 mm；2017年10月采自河南省洛阳市伊川县河滨街(伊河水系)(112°47′39″E，34°52′55″N)、河南省洛阳市洛龙区凌波大桥(洛河水系)(112°38′57″E，34°59′91″N)；采集人：邱宁。

形态描述测量新种标本26尾，全长72.7～112.4 mm，体长61.1～92.4 mm。相关可量、可数性状见表2。新种体长而侧扁，腹圆，头长略大于体高。唇较薄，光滑。口端位，口裂较小，稍向上倾斜，上颌稍长于下颌，上、下颌平整无缺口，向后延伸未到或刚到达眼前缘下方。眼较大，位于头侧中上方。鼻孔较大，位于眼前方。围尾柄鳞13～17，鳃耙排列疏松，第一鳃弓外侧鳃耙10～12，内侧12～17，末端成钩状。

背鳍无硬刺，位于体中部，外缘呈弧形；胸鳍末端尖，未到达腹鳍基部，背鳍略长于胸鳍；腹鳍小，外缘呈弧形，未到达肛门，腹鳍起点与背鳍起点相对；臀鳍基部长，臀鳍第二、三根分枝鳍条最长，可到达尾鳍基部。尾鳍分叉，上下叶几乎等长。肛门离臀鳍起点很近，臀鳍基长较背鳍基长长。体侧鳞片中等大小；侧线完全，且在胸鳍后方向下弯曲，然后再向上延伸到尾柄中部。胸部与腹部均有鳞片覆盖，胸部及腹中线的鳞片埋于皮下，不甚明显。

体色生活时鲜艳，雄鱼比雌鱼明显。眼睛上边缘橘红色，背部灰色带橘黄色，腹部银白色，体侧胸鳍到臀鳍起点之间具有3～8条不规则的灰绿色条纹，雄鱼体侧条纹明显，雌鱼体色条纹不明显。背鳍分枝鳍条分为三部分：基部鳍条边缘黑色，鳍间膜夹杂黑色颗粒，中部鳍条透明，鳍间膜黑色条纹，外缘各鳍边缘黑色，鳍间膜透明。胸鳍灰白色或橘黄色，腹鳍灰白色，臀鳍灰白色或浅黄色。福尔马林固定的样本背部灰黑色，腹部灰白色，背鳍基部黑色，尾鳍分叉，边缘黑色。

地理分布该种目前仅知分布于大凌河水系和黄河流域。

词源新种种名源自拉丁文“sinensis”，意为“中国的”，指的是该物种的产地。

图2 中华， ♂ (正模标本， IHB 180407020， 体长79.8 mm)Fig. 2 Zacco sinensis sp. nov， male (holotype， IHB 180407020， 79.8 mm standard length)

表2 中华的可数性状和测量比例性状Table 2 Meristic characters and proportional measurements of Zacco sinensis sp. nov.

3 分子系统发育分析

本研究中，使用18种马口鱼类的线粒体cytb基因序列共44条，另外采用2条细鲫属Aphyocypris鱼类的cytb序列作为外类群。所有序列经比对分析后，得到单条全长为1 140 bp的序列集。序列中无碱基的插入或缺失，该片段A、T、G、C的碱基含量平均值分别为(不含外群)25.7%、30.1%、16.4%、27.8%。A+T含量(55.8%)高于G+C含量(44.2%)，与鱼类线粒体基因A、T含量高，G、C含量低的特点基本一致。1 140个位点中，保守位点708个，占总位点数的62.1%；变异位点432个，占37.9%；单突变位点27个，占2.4%；简约信息位点405个，占35.5%。所有序列转换颠换比平均值为5.08。

图3 基于cyt b基因序列构建的马口鱼类邻接树， 节点处数值为NJ/BI/ML分析中所得的支持率(仅显示大于50/0.5)Fig. 3 Phylogenetic relationships of opsariichthine derived from NJ tree based on cyt b gene sequences， values at thenodes correspond to the support values for NJ/BI/ML methods (above 50/0.5 are shown)

4 讨论

表3 中华与2个同属近似物种的主要鉴别特征Table 3 Principal diagnostic characters for Zacco sinensis sp. nov. and its 2 related congeners

致谢：感谢中国科学院水生生物研究所胡华明老师、倪述、邱宁在野外采集标本方面提供的诸多帮助，感谢张旭在地图制作上提供的帮助，感谢张智、沈中源、王雪在软件使用上提供的帮助。