张 丽，孙国栋

(邯郸市中心血站,河北邯郸 056001)

血站实验室的血液筛查工作是保证临床输血安全有效的重要屏障。虽然现阶段在酶联免疫法检测乙肝表面抗原(HBsAg)、HCV抗体(抗-HCV)、HIV抗体(抗-HIV)性能上有很大程度提高，但对于病毒窗口期、静默感染等[1]却是无法检出，而核酸检测技术具有高度敏感性和特异性，有利于隐匿性感染的检出,有利于缩短病毒检测窗口期。核酸检测抗干扰能力弱，对设备及环境、人员等要求高，核酸检测实验室的质量管理就显得尤为重要[2]。本中心血站自2018年起参与了京津冀血液筛查实验室的质量指标监控，为提高本站血液筛查能力提供了优质的学习资源和平台。笔者以此为契机通过对拆分阳性率的数据进行比对与回顾性分析，从这一角度客观评价检测过程的运行状况，目的在于发现问题所在，以便在工作中寻找相应解决方案。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取2016年1月至2018年12月河北邯郸地区18～55岁的无偿献血者标本共274 309份。采集献血者静脉血标本共2管，使用乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝的负压真空管留取标本,其中1管为8 mL(有分离胶)用于核酸检测，另外1管5 mL(无分离胶)用于血清学检测。核酸管采血后，需要在4 h内离心,置于2～8 ℃冰箱保存,各检测需在72 h内完成。

1.2仪器与试剂 核酸检测试剂为华益美核酸检测试剂盒；酶联免疫吸附测定(ELISA)使用的试剂为上海科华、北京万泰、珠海丽珠、厦门新创公司的产品。以上试剂均批检合格,不同批号试剂均在有效期内使用。仪器包括FAME2430全自动酶联免疫分析系统、ABI7500扩增仪、尤瑞纳斯AE280全自动酶免一体机、Hamiltom Star全自动加样仪和全自动核酸提取仪。各实验操作均严格按照《血站技术操作规程》和试剂盒说明书要求进行。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计软件对此研究分时间、分试剂批号的阳性检出率、拆分阳性率进行统计，各组阳性率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1核酸检测情况 共检测核酸标本274 309份,一部分为其中一种试剂检测反应性判为待查的标本；另一部分为经过ELISA检测后2个试剂厂家均为阴性的标本。其中混样反应率0.12%(335/274 309)，拆分阳性数152例,拆分阳性率为45.97%。2016至2018年拆分阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=6.16，P<0.05)。见表1。

2.22018年1-12月拆分情况汇总 由表2可见，2018年全年混检阳性pool数为135，拆分阳性pool数为70，拆分阳性率为51.85%(70/135)。1-12月拆分阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2016～2018年核酸检测情况汇总

表2 2018年1-12月拆分情况汇总

注：1-12月拆分阳性率比较,χ2=63.61，P<0.05,差异有统计学意义。

3 讨 论

《血站实验室质量管理规范》规定，血站实验室必须建立和持续改进实验室质量体系，并负责组织实施和严格监控[4]。通过对核酸检测拆分阳性率的统计，可以有效评估整个核酸检测系统的稳定性，以及所使用的核酸试剂的性能。

2016年1月至2018年12月本站共检测核酸标本274 309份,其中混检反应率为0.12%,与北京0.14%[5]、宝鸡0.15%[6]等地相比略低。拆分阳性152例,拆分阳性率为45.97%,低于临近的唐山地区79.45%[7]、安阳地区75.00%[8]；徐州地区63.3%[9],渭南地区的61.11%[10]。阳性检出率为0.55‰,与大连0.50‰[11]相似,低于国内一些城市[12-14]。原因可能与以下因素相关：(1)使用单人份HBV DNA试剂灵敏度高于混样核酸检测;(2)由于核酸检测系统的反应原理不同,系统设计不同,操作流程各有差异,导致病毒检出率有所不同；(3)人群分布的地域差异导致病毒检出率的差异； 2015年底本站开展核酸检测以来，标本数量逐年上升，拆分阳性率也相应提高，2016年与2017年基本持平，2018年则提高较多原因可能有以下三点：(1)在开展核酸检测初期，操作人员对设备的使用缺乏经验，导致检测结果出现一定波动；(2)本单位所使用的试剂在抗污染方面有待提高；(3)2018年本单位参加京津冀血液筛查实验室质量分析，按照要求又对实验环节进行进一步的严格把控，不断提高实验的有效拆分。而前两点在2018年也有了较大改善，故2018年的拆分阳性率同比增长约15%。本核酸实验室拆分阳性率也高于在2018年京津冀血液筛查实验室质量指标数据汇总分析中的拆分阳性率均线48.94%。

在2018年拆分的70例阳性中有1例标本,第1次拆分检测阴性,但有线下起跳的现象,根据本站核酸检测操作规程,结合扩增曲线特征,为此进行第2次拆分结果为阳性,且循环阈值(Ct)值范围为>39～43。这与赵欣等[15]的报道相似。而在之前本核酸实验室统计过Ct值在此范围里的标本拆分阳性率有42.86%,这提示在未被拆分出的标本中可能存在以下原因：(1)标本混检阳性为假阳性结果，虽然核酸检测灵敏度较高，但检测中存在一定的不确定度，对人员操作，环境控制，抗污染能力要求较高[16]，容易造成非特异性扩增。(2)如果病毒的浓度处于试剂盒检测限以下或极低水平,由于病毒颗粒在血浆中泊松分布,吸样时未必能每次都吸取到含有一定量病毒的样本,从而影响检出,造成假阴性；(3)不合适的保存温度、不规范的运送条件、其他干扰物的存在都可能导致病毒降解造成假阴性的产生。

美国临床实验室标准委员会CLSI-GP35D关于监控指标的文件里[17]，明确了混检阳性率是混检阳性标本个数与检测标本个数之比，若混检阳性率出现升高，应观察拆分阳性率，若拆分阳性率呈现下降，提示该实验室在检测过程中存在污染的风险有所增加。此时应该排查可能导致污染的步骤，并对可能导致污染的因素进行评估[18]。本实验室每月月初对上一月核酸检测情况进行回顾性总结与分析，当分析发现拆分阳性率下降的情况出现时，首先会对操作环节进行加强培训，例如操作人员的再培训，室内温湿度控制，操作时防污染控制，调整试验完毕后的消毒措施；其次分析检测系统本身的原因，例如在人员、环境、操作步骤都相对固定的情况下，若某批次试剂在使用过程中出现拆分阳性率虽然在平均水平，但检出率却明显超出平均水平的情况，需将此批号所检出的阳性标本均留样并送卫健委临检中心实验室进行确证，待结果回报后再进行分析总结。

综上所述，现行的监控指标可以有效地监控并保障每批次试验正常运行。血站血筛实验室的运行状况直接关系到血液安全，应通过从“人、机、料、法、环”等方面查找漏洞，及时发现影响质量的不稳定因素并采取措施，使血站血筛实验室质量监控不断完善。