姜宇航,宋利娜,许 汪,杜寿文,陈 竞,付婷婷,郝鹏飞,李秋璇,金宁一∗,李 昌∗

(1.吉林农业大学 动物科技学院,吉林 长春130118；2.军事医学研究院 军事兽医研究所 省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林 长春130122)

猪圆环病毒2 型(porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),是迄今为止发现的最小动物病毒之一[1]。呈二十面体对称,为无囊膜单股环状负链DNA 病 毒[2]。PCV 主 要 分 为PCV1、PCV2 和PCV3[3]。其中PCV1对猪群没有致病性；PCV2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,导致猪只生长发育缓慢、渐进性消瘦等[4-5],并且会侵害猪的淋巴系统引起免疫抑制,导致疾病的进一步加重[6-7]；PCV3 是近年来新发现的一种PCV,在猪皮炎肾脏综合征病料中检出率较高,且与母猪死亡和流产相关[8]。

PCV2基因组中包含11 个开放阅读框(open reading frames,ORFs),然而仅有3个ORFs可以编码蛋白。其中,ORF1和ORF2是最主要的2个阅读框,ORF1 编码与病毒复制相关的蛋白[9]。ORF2 编码包含233～235 个氨基酸大小的结构蛋白(capsid protein,Cap)。临床方面,PCV2 主要感染家猪和野猪,大多数在4～11周龄时感染。临床常见的PMWS表现包括仔猪消瘦、呼吸困难和淋巴结明显肿大[10-11]。PDNS临床特征为红色到紫色的不规则斑块和皮肤丘疹,皮下出血和水肿,以浅表腹股沟为主的淋巴结肿大,双侧肾脏扩大、小皮质瘀斑和肾盂水肿等症状。目前,PCV2 在全球范围内发生流行,死亡率在10%～30%,严重者高达40%,成为危害养猪业的主要疾病之一[12-13]。

PCV2 Cap蛋白与病毒感染、免疫保护有着密切关系,本试验着手于研究PCV2 Cap基因在大肠杆菌中的表达,以期获得目的蛋白,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料TransStart FastPfu Fly Polymerase、p EASY-Blunt Simple购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA Ligase,Color Prestained Protein Standard Broad Range 购 自NEB 公 司；DL5000 DNA Marker、Trans5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞购自大连Ta KaRa公司；TMB 单组分显色试剂购自索莱宝公司；胶回收试剂盒购自BioFlu X 公司；质粒小提试剂盒购自杭州AXYGEN公司；XhoⅠ,Bam H Ⅰ,氨苄青霉素,卡那霉素,10 000 透析袋购自Thermo Scientific；Anti-6×His tag抗体购自Abcam；Western及IP裂解液、山羊抗鼠IgG、BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司；Ni Focurose 6FF(IMAC)购自汇研生物；HBp ET 自诱导培养基购自海博生物技术有限公司；尿素购自生工集团；完全弗氏佐剂,不完全弗氏佐剂购自Sigma；p ET-28a载体由本试验室保存。

1.2 引物合成与设计参考实验室保存的PCV2 Cap基因,送至上海捷瑞公司进行基因优化并设计1对特异性引物。上游引物PCV2-F添加Bam HⅠ酶切位点：GGATCCATGACGTATCCAAGGAG,下游引物PCV2-R 添加XhoⅠ酶切位点：CTCGAGCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC(斜体加下划线为限制性核酸内切酶识别位点)。扩增片段全长为714 bp,引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.3 PCV2 Cap基因PCR扩增以含有PCV2 Cap基因的质粒作为模板,分别用上述引物进行目的基因扩增。反应条件：94℃2 min；94℃20 s,60℃20 s,35 个循环；72℃20 s,72℃5 min,4℃保存。扩增结束后,通过1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段,克隆至p EASY-Blunt载体上,经质粒转化至Trans5α感受态细胞并涂布于固体LB 平板上,挑取单克隆菌株在液体LB中培养12 h。提取质粒分别用Bam HⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定,并测序进一步确认,将测序正确的质粒命名为p EASYPCV2-Cap。

1.4 原核表达质粒pET-28a-PCV2-Cap的构建将验证正确的p EASY-PCV2-Cap质粒与原核表达载体p ET-28a分别用Bam HⅠ、XhoⅠ进行双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段,T4DNA Ligase连接过夜,转化至BL21(DE3)感受态细胞中,涂布于固体LB平板上,挑取单克隆菌株在液体LB中培养12 h；保存菌种,少量提取质粒后分别用Bam HⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定,将验证正确的质粒命名为pET-28a-PCV2-Cap。

1.5 HB-p ET自诱导培养基诱导表达PCV2 Cap蛋白将测序正确的p ET-28a-PCV2-Cap菌种,以1∶50的比例接入HB-p ET 自诱导培养基,过夜培养；离心收集菌体,将菌体用适当的PBS 重悬超声破碎,再次离心沉淀吸出上清,用适当的PBS重悬沉淀,上清与沉淀分别制备蛋白样品,12%蛋白电泳后进行Western blot验证,使用His tag抗体作为一抗,山羊抗鼠IgG 作为二抗,验证其表达。

1.6 PCV2 Cap蛋白纯化大量制备HB-p ET 自诱导培养基并接入大肠杆菌p ET-28a-PCV2-Cap,过夜培养并收取菌体；应用尿素Tris-HCl平衡缓冲溶液将其重悬,并运用超声破碎仪对菌体进行超声破碎,获得p ET-28a-PCV2-Cap 蛋白悬液；在37℃摇床上振荡裂解包涵体2 h,离心除去菌体沉淀；将蛋

白与Ni Focurose 6FF(IMAC)进行结合,并用含有咪唑的平衡缓冲溶液进行梯度洗脱(20,50,100,200,300 mmol/L),收取蛋白流穿液与洗脱液制备蛋白样品,进行SDS-PAGE验证。

1.7 蛋白复性将纯化后的蛋白装入10 000透析袋中,将透析袋放入蔗糖中进行浓缩,然后放入玻璃烧杯,加入适当的平衡缓冲溶液并每隔1 h,向其中加入一部分Tris-HCl溶液,直至外部烧杯中的溶液完全为Tris-HCl溶液为止。析出透析袋内的液体并进行离心收取上清,BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度。

1.8 鼠源多克隆抗体的制备在进行首免之前对小鼠进行眼球采血作为阴性对照,并在首免后每周进行采血制备血清；将复性后的PCV2 Cap蛋白以每只100μg配伍完全弗氏佐剂进行首次免疫,于免疫后14,28 d每只再以50μg复性蛋白配伍不完全弗氏佐剂进行二、三免,第4 次加强免疫于首免后42 d以200μg的量进行。

1.9 间接ELISA 检测将纯化后的PCV2 Cap蛋白以5 mg/L包被至ELISA 平板,每孔100μL,4℃冰箱包被过夜；每孔加入100μL 5%脱脂乳37℃封闭1 h；加入100μL倍比稀释的小鼠血清37℃孵育1 h；加入100μL 1∶3 000稀释的山羊抗鼠HRP二抗37℃孵育1 h；再加入100μL的TMB显色液,最后加入50μL 2 mol/L H2SO4终止液终止试验。在每一次操作后每孔用200μL PBST 清洗3次。用酶标仪检测D450值,当P/N≥2.0 时判为阳性。

1.10 鼠源抗PCV2血清的Western blot检测将纯化的PCV2 Cap蛋白作为抗原超声破碎加入1×蛋白上样缓冲液,煮沸5 min,以1 000倍稀释的鼠源抗PCV2血清作为一抗,将山羊抗小鼠HRP 1∶5 000 稀释作为二抗,进行Western blot检测。

2 结果

2.1 PCV2 Cap基因PCR 扩增使用设计引物扩增PCV2 Cap基因,可见约720 bp的目的条带(图1),与预期结果一致。PCV2 Cap基因回收后连接至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-PCV2-Cap,进行XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切验证,在720 bp左右位置可见条带(图2),与预期相符,进一步DNA 序列测定结果显示,该片段与原序列完全一致,表明成功获得目的基因。

2.2 重组穿梭质粒的构建与鉴定将测序正确的PCV2 Cap基因连接至p ET-28a原核表达载体上,进行XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切验证,在720 bp左右位置可见条带(图3),与预期结果一致,进一步测序结果显示与原序列完全一致,表明成功构建穿梭质粒p ET-28a-PCV2-Cap。

图1 PCV2 Cap 基因扩增 M.DL5000 DNA Marker；1.PCV2 Cap PCR 产物

图2 重组质粒p EASY-PCV2 Cap 酶切鉴定 M.DL5000 DNA Marker；1.重组质粒；2.重组质粒双酶切

图3 重组质粒p ET-28a-PCV2-Cap 双酶切鉴定 M.DL5000 DNA Marker；1.重组质粒；2.重组质粒双酶切

2.3 PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中的表达SDSPAGE及Western blot验证PCV2 Cap蛋白,结果如图4所示,目的蛋白大小位置的上清与沉淀均出现大小为28 000左右的条带,表明目的蛋白成功表达,并具有抗原性。

2.4 PCV2 Cap蛋白的纯化与复性利用His标签进行蛋白纯化,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE 验证,在100 mmol/L咪唑处可见28 000左右的目的蛋白条带(图5),并对其进行蛋白复性,BCA 蛋白定量法检测,得到蛋白质量浓度约为0.6 g/L。

图4 重组蛋白pET-28a-PCV2-Cap 表达验证 A.SDSPAGE；B.Western blot。M.显色蛋白质标准；1.p ET-28a空载体对照组；2.重组蛋白p ET-28a-PCV2-Cap上清；3.重组蛋白p ET-PCV2-Cap沉淀

2.5 多克隆抗体制备及ELISA检测以5 mg/L的PCV2 Cap蛋白作为包被抗原,以未免疫鼠的血清作为阴性对照,测定鼠源抗PCV2血清的效价。将鼠源抗PCV2血清和阴性对照血清稀释100,1 000,5 000,10 000,15 000,20 000倍,结果显示,首免后21 d抗体效价达到峰值,鼠源抗PCV2血清稀释至10 000倍时,P/N＞2.0,说明鼠源抗PCV2血清效价大于1∶10 000。

2.6 小鼠免疫血清检测PCV2 Cap蛋白用鼠源抗PCV2的血清作为一抗对PCV2 Cap表达蛋白进行检测(图6),0周血清作为阴性对照,从结果可以看出,0周并未出现条带,2,4,6周均出现特异性条带,证明该蛋白具有有较好的反应原性,鼠源特异性抗体能对PCV2蛋白进行特异性识别。

图5 重组p ET-28a-PCV2-Cap 的纯化与复性 M.显色蛋白质标准；1.p ET-28a 空载体对照组；2.重组蛋白p ET-28a-PCV2-Cap原液；3.浓缩后PCV2 Cap蛋白；4.复性后PCV2 Cap蛋白

图6 p ET-28a-PCV2-Cap小鼠多抗对原核表达蛋白的检测

3 讨论

PCV2作为目前已知最小的动物病毒,是导致包括仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、新生仔猪先天性脑震颤、增生性坏死肺炎以及怀孕母猪的繁殖障碍等疾病的主要病原,对全世界范围内的养猪业造成了巨大的打击,因此PCV2成为近几年国内外兽医领域的研究热点之一。研究表明,PCV2 Cap蛋白具有良好的免疫原性,能诱导机体产生保护性抗体[14]。所以在诊断及预防方面,Cap蛋白都发挥着重要作用。目前国内PCV2存在的基因型主要有PCV2a、PCV2b和PCV2d[15]。本试验所用的毒株原型为本试验室保存的毒株,是PCV2d基因型,作为新出现的基因型并在中国国内普遍存在,所以将PCV2d基因型作为主要的研究对象。

由于大肠杆菌表达系统表达外源蛋白具有繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定、基因克隆表达系统成熟完善、目标基因表达水平高、代谢途径和基因表达调控机制比较清楚等优点,所以本试验采用大肠杆菌系统表达PCV2 Cap 蛋白[16]。本试验通过PCR 扩增PCV2 Cap 蛋白编码基因,成功构建p ET-28a-PCV2 Cap原核表达质粒,在BL(DE3)感受态细胞中进行表达。在使用大肠杆菌对外源蛋白进行扩大培养及表达时,表达量过多容易形成包涵体,包涵体一般只溶于强的变性剂如尿素、盐酸胍,它是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,而我们现在实验室应用的变性剂多为尿素,属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。本试验亦采用该种方式,使PCV2 Cap蛋白上的His标签暴露出来,这样使PCV2 Cap蛋白更容易结合在NI柱上,通过咪唑与镍离子的竞争性结合,达到洗脱目的。按照梯度洗脱依次从低浓度向高浓度进行洗脱,低浓度的咪唑可以帮助洗脱掉挂在NI柱上的杂蛋白,以便于在高浓度的咪唑中洗脱出单一蛋白。本试验通过亲和层析纯化得到单一的PCV2 Cap蛋白并使用透析袋浓缩透析并复性,得到复性后的目的蛋白。

蛋白复性成功后,对小鼠进行皮下注射免疫PCV2 Cap蛋白,制备小鼠多抗。使用小鼠进行多克隆抗体制备,与使用新西兰大白兔相比得到的抗体具有蛋白使用量相对较少、容易操作及饲养、成本低的优点。多抗制备后,用ELISA 对其效价进行检测,发现在第3周时效价达到最高,最高可达104。为了进一步验证其活性,对小鼠多抗进行稀释作为一抗,山羊抗鼠IgG 作为二抗,检测PCV2 Cap阳性蛋白,结果显示,免疫后不同时间都可清晰的看到大小为28 000的目的条带,表明制备的小鼠多克隆抗体具有很好反应活性。并且与免疫效价达到1∶10 000 时在Western blot中可清晰的检测到目的蛋白。多克隆抗体作为重要的免疫诊断材料,其与单克隆抗体相比有着独特的优势,能识别多个抗原表位,即使少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变,结果也不会受到影响,并且制备方法较易、成本较低。

本试验成功构建含有PCV2 Cap基因的原核表达质粒p ET-28a-PCV2-Cap,并成功表达获得具有生物活性的重组蛋白,对该蛋白进行纯化与复性后,免疫小鼠获得反应原性较好的鼠源多克隆抗体,为下一步深入开展该蛋白功能研究、鉴定及抗体制备、疫苗研发奠定理论基础。