亓传旺

HBV持续感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)严重危害人类健康，尽管疫苗和抗病毒药物的使用延缓了疾病进展及降低了肝癌的风险，但乙型肝炎仍是全球重要的公共健康问题。据统计全球仍有2.4亿(其中我国逾0.9亿)人受到慢性HBV感染，每年近百万人死于HBV慢性感染相关肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌等肝脏疾病[1]。目前，临床上用于CHB治疗的药物主要有两大类，包括干扰素(interferon，IFN)和核苷(酸)类似物[Nucleoside (acid) analogues，NAs]，但均不能有效清除病毒和治愈乙型肝炎[2]。随着研究的进展，免疫治疗成为一个热点。

一、Tfh辅助的B细胞介导的体液免疫应答在慢性HBV感染功能性治愈中的作用

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)耗竭被认为是目前主要的治疗结点，并反映了HBV感染功能性治愈。然而，相当有限的病人获得HBsAg耗竭，并产生乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)，况且HBsAg耗竭也不意味着病毒完全清除。以往研究主要集中在细胞免疫对HBV的清除的作用，认为多特异性和有活性的HBV特异性CD8+T细胞反应与病毒清除有关，对于以HBV包膜蛋白即HBsAg为靶目标的中和抗体的作用极少关注,近来发现Tfh辅助的HBsAg特异性B细胞产生的抗-HBs在慢性HBV感染功能性治愈中起重要作用。

(一)抗-HBs自然史及经典作用 无论是在急性感染痊愈后，还是在慢性HBV感染经药物诱导或自发性的HBV清除，抗-HBs多数只在感染HBV的人群HBsAg 消失后的血液中才可检测到(少数出现病毒变异的感染者可同时出现HBsAg和抗-HBs)。所以抗-HBs在HBV清除中似乎没有起主要作用。而有学者发现，抗-HBs 的出现不但是抗原清除的结果，还具有通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC )杀伤靶细胞促进抗原清除的能力以及和HBsAg构成免疫复合物激活HBV特异性T细胞的作用。其次，乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)中含有的抗-HBs可防止肝脏移植前后HBV感染以及HBV感染母亲向新生儿的垂直传播。再次，如风湿科和肿瘤科常用的B细胞耗竭药物“美罗华”可诱导HBV携带者、甚至“功能性治愈”患者HBV再激活。

(二)产生抗-HBs的HBsAg特异性B细胞特征 Salimzadeh等人发现：数量上，在急性、慢性和功能性治愈HBV感染者中HBsAg特异性B细胞以相似的频率出现。功能上，不但长期服用NAs治疗的慢性HBV感染者的B细胞缺陷持续存在，表现为增殖能力降低、受HBsAg刺激后不能产生抗-HBs，从急性HBV感染患者中分离的HBsAg特异性B细胞也不能在体外成熟为分泌抗-HBs的细胞，功能性治愈者这种功能缺陷得以恢复。进一步RNA测序显示：HBV感染者B细胞高表达包含FcRL家族在内的多种抑制性受体，而关于抗原提呈的基因下调[3]。从表型分析来看，急性和慢性HBV感染者的这些HBsAg特异性B细胞类似于“非典型记忆性B细胞”，以低表达CD21和CD27、高表达抑制性标记物如程序性死亡受体1(progremmed cell death 1，PD-1)和转录因子T-bet为特征，并在HBV感染患者的肝脏、感染部位和炎症中积聚, 高表达FcRL5的CD10-CD19+CD21-CD27-“非典型记忆性B细胞”亚群持续扩增，最终分化为浆细胞后产生抗-HBs[3，4]。这种功能和表型障碍不仅限于HBsAg特异性B细胞，还波及HBV感染者的全身B细胞群[5]。实验证实这种HBsAg特异性B细胞的功能障碍可以通过特定的培养条件如PD-1阻断或添加白介素-2(Interleukin-2，IL-2)，IL-21和CD40配体(CD40L)在体外部分恢复[6]。

以上结论证明B细胞功能障碍是急性和慢性HBV感染缺乏抗-HBs的主要原因，这些研究发现也为将滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells ，Tfh)辅助的B淋巴细胞介导的体液免疫应答作为新型抗病毒策略从而实现CHB功能性治愈的目标打开了一扇大门。

(三) Tfh表面分子标志及其与CHB患者关系 Tfh是一种CD4+T淋巴细胞亚群，能够稳定持续地表达趋化因子受体5(Chemokine receptor 5，CXCR5)和高水平的可诱导共刺激分子(Inducible Costimulators，ICOS),通过CXCR5，Tfh能与B淋巴细胞定位到相同的淋巴滤泡，并与其相互作用活化B淋巴细胞，形成生发中心(germinal center,GC)，B淋巴细胞进一步分化，产生抗体[7-8]。外周血CD4+CXCR5+细胞被认为是外周记忆性Tfh，具有与Tfh相似的功能特征[9]。阻断ICOS能显著减少IL-21的表达，并导致GC形成障碍以及Tfh缺失[10]。研究发现，CHB患者血液中CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+CXCR5+显著高于健康对照组[11]。处于免疫清除期的CHB患者CD4+CXCR5+Tfh水平最高, 并与疾病的活动性相关,CD4+CXCR5+Tfh频率与HBV DNA载量呈负性相关, 提示CD4+CXCR5+Tfh的增高可能有利于机体对HBV的清除[12]。来自印度的一项研究发现，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+Tfh在CHB患者的HBsAg血清学转换方面起着非常重要的作用,在治疗中获得HBsAg血清学转换组的IL-21、IL-17水平均显著增高，CD4+CXCR5+Tfh显著富集，Tfh诱导CD4+ICOS+Tfh的表达显著增强[13-14]。因此, 外周血CD4+CXCR5+Tfh的测定, 可能为慢性HBV感染患者治疗时机的选择提供依据。

(四) Tfh亚群及对HBV感染者B细胞影响 近来发现位于GC的Tfh具有部分Th1、Th2及Th17细胞的特征, 能产生Th1, Th2及Th17相关细胞因子。Morita等[15]发现人类外周血CD4+CXCR5+Tfh具有不均一性, 包含CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)样亚群及Th1、Th2、Th17样Tfh，其中Th2及Th17样Tfh能够对B细胞提供辅助, 而Th1样Tfh则不能辅助B细胞。CD25+Foxp3+Treg样亚群在慢性HBV感染者体内富集并能促进调节性B细胞功能。和CD25-Tfh亚群相比，CD25+Tfh亚群分泌较低水平的IFN-γ，IL-17和较高水平的TGF-β，其介导CD20-/loCD38+浆母细胞分化的能力不及CD25- Tfh亚群[16]。

FoxP3+Treg是一群专职主动抑制组织特异性抗原或外来抗原的细胞, 它不仅能够抑制Th1、Th2、Th17等效应T细胞所介导的免疫反应，还能迁移到淋巴滤泡对Tfh的功能进行调节。 李惠凤等研究， 与慢性无症状HBV携带者(chronic asymptomatic HBV carriers, AsC)比较，HBeAg(+)CHB患者外周血FoxP3+Treg数目有降低的趋势，而CD4+CXCR5+Tfh数目有增高的趋势，提示由AsC进展到HBeAg(+)CHB的过程中, FoxP3+Treg降低， 使得AsC打破免疫耐受进入免疫清除期，同时伴有CD4+CXCR5+Tfh的增多，以便对B细胞提供更有利的辅助，为CHB功能性治愈提供机会。

除上述研究之外，董庆洋等[17]发现, 慢性 HBV感染发生的原因在于 Treg上面细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4)的抑制性作用。具体而言在慢性HBV感染者中，由于脾脏中病毒特异性Treg细胞的大量分化，其表面的CTLA-4阻止了与抗-HBs相关的Tfh细胞和GC B细胞的分化，进而导致了慢性化的发生,使用CTLA-4的封闭性抗体处理后，可诱导正常Tfh细胞和GC B细胞分化,并分泌抗-HBs,加速HBsAg清除，实现功能性治愈。

近年进入临床、多用于肿瘤(如急性淋巴细胞性白血病)的嵌合抗原受体 (CAR-T)治疗是通过外在手段激活患者的免疫系统达到治疗疾病的目的。具体的，将自体T淋巴细胞分离出来，在体外进行重构或诱导刺激，然后回输体内去杀伤肿瘤细胞。研究结果显示[17]，使用 CTLA-4 的封闭性抗体处理慢性 HBV 患者外周血后，在 HBsAg 抗原的刺激下，可以诱导分泌 IL-21 的Tfh的分化，促进 GC B 细胞的形成，进而加速抗原的清除以及抗体的产生，从而彻底的清除掉HBV病毒。这种针对 CTLA-4 的抑制性作用的封闭抗体来挽救异常的体液免疫，也给慢性 HBV 感染的治疗提供的新的方向，不过还需对其中机制进行深入探索。

二、功能性治愈有望通过基因和(或)免疫治疗实现

临床治疗上看，目前针对 CHB患者的治疗可以达到抑制 HBV 病毒复制的效果，但是不能从根源上清除掉共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA， ccc DNA)。HBsAg一定程度上反应cccDNA含量， cccDNA病毒微型染色体持续存在及转录活性是HBV复制及HBsAg合成的基础。可通过以下途径降低HBsAg水平，潜在的修复固有免疫及适应性免疫，如消除或沉默cccDNA 转录活性；通过反义寡核苷酸或小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)干扰病毒转录；干扰包膜蛋白合成及血液中半衰期[18]。HBV药物研发和治愈最大挑战就是把cccDNA 库作为靶目标以及攻克关于耗竭的适应性免疫应答的效应分子。

(一) RG7834 来自Roche的研究者报道发现一种新型口服生物可利用的HBV基因表达的小分子抑制剂(RG7834)[19]。有学者已在HBV感染样本(HepaRG细胞)、正常人肝细胞、HBV感染尿激酶型纤溶酶原激活物/严重联合免疫缺陷的人乳化鼠模型中评估了RG7834单药或联合恩替卡韦抗HBV特性和选择性，结果显示：RG7384显著降低病毒蛋白(包含HBsAg)水平，也降低了病毒血症。Time course RNA-seq分析显示对RG7834治疗应答的人群，选择性减少HBV mRNA s。进一步研究，联合RG7834、恩替卡韦、Peg-IFN-α治疗也引起人乳化小鼠HBV DNA和HBsAg水平明显降低。RNAseq和northern blot分析表明RG7834可直接或间接修改病毒RNAs并促进它们降解[20]。一项近期研究显示dihydroquinolizinone混合物依靠HBV 转录后调节元件加速病毒RNA降解，并和RG7834有相似活性[21]。考虑到它口服给药及高度选择性，潜在的临床用途似乎很有希望。

(二) EDP-514 它是一种治疗HBV感染的新型二代核心抑制剂(也称为衣壳组装调节剂或核心蛋白质变构调节剂)，是 Enanta Pharmaceuticals 的核心抑制剂候选物，已被证明可在HBV生命周期的多个步骤中起作用，当在HBV感染期间早期给予时，可以防止原代人肝细胞中新的cccDNA重新形成。体外数据显示 EDP-514 也是一种泛基因型药物(即对目前常见的乙肝病毒基因型均有效)，且EDP-514与核苷逆转录酶抑制剂(NRTI，HBV的当前抗病毒疗法)或I类核心抑制剂的联合用药还可以获得叠加和协同抗病毒效应。

(三) NAPs 专注于CHB和慢性丁型肝炎功能性治愈的私营生物制药公司Replicor近日在新加坡举办的The Science of HBV Cure 2019 会议上公布了核酸聚合物(NAPs; REP 2139-Ca and REP 2139-Mg，是阻断亚病毒颗粒组装的新型抗病毒药物，从而阻止HBsAg释放以及在联合多种免疫治疗时清除HBV，实现感染的功能性控制)研究的最终随访数据。这项研究主要评估 HBeAg 阴性CHB患者在 TDF 和Peg-IFN基础上加用 REP 2139-Mg 或 REP 2165-Mg 的影响，83%的参与者实现了对感染的功能性控制，并且根据现有的指南标准不需要继续用药治疗[22]。

(四) GS-4774+PD-1 之前的研究已经证实治疗性乙肝疫苗 GS-4774 单药用药对降低 HBsAg 用处不大，但最新的研究发现PD-1抑制剂 Nivolumab跟治疗性乙肝疫苗GS-4774 的联用能使大多数患者HBsAg 下降，并使1例患者 HBsAg 持续消失。或许综合两者的作用机制、采用两者联合用药的研究也是未来的重要方向之一[23]。