陈朗军，吴林烨，李达谅

（福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117）

DNA是重要的遗传物质，在遗传信息的传递、复制中发挥着重要作用。很多疾病是由于某些关键基因DNA发生突变或损伤引起的，如镰刀型细胞贫血病等[1,2]。对于这些疾病的诊断和治疗则需要借助特定的工具。寡核苷酸具有链长短，序列复杂度低等特点，适用于开发新型治疗用药物[3]、或是设计新型分子生物学研究工具[4]，但寡核苷酸存在着一些不足与缺陷，如其抵御核酸酶降解的能力较弱、杂交分子的热稳定性差、会同蛋白产生非特异性结合等。为了有效克服寡核苷酸的这些缺点，众多的核酸类似物在参考核酸基本结构的基础上被设计合成出来。肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）因其独特新颖的物理化学及生物化学特性、稳定性和对核酸酶与蛋白酶的良好抗性，与互补链显著的相互作用和显著的杂交属性而成为其中一个单独的且值得注意的类别[5]。基于其独特的性质，PNA在分子杂交和诊断领域发挥重要作用，有望被开发成为抗肿瘤的新型免疫制剂。本文对PNA的合成以及其在肿瘤免疫学研究中的应用进行综述。

1 肽核酸的结构和特性

1.1 肽核酸的化学结构及其理化性质

PNA的化学结构同DNA和RNA类似，均是由骨架、碱基以及碱基同骨架连接部分组成，不同之处在于构成PNA的单体之间是通过一个非自然的假肽链相互连接，其结构如图1所示。

图1 DNA和PNA骨架结构对比

由于肽核酸是通过非自然的假肽链进行连接的，故其具有一些核酸不具备的独特性质：

⑴ 相比带有负电荷的DNA和RNA的核糖磷酸骨架，肽核酸的骨架是不带电荷的，这就减少了其双链间的排斥作用，从而具有比DNA或RNA更高的亲和力和稳定性。

⑵ 由于肽核酸为外界人工合成的类核酸物质，结构中不含氨基酸残基或磷酸戊糖单元，故绝大部分的核酸酶和蛋白酶无法对其进行有效降解。

⑶ 肽核酸的非手性构象便于单体合成与纯化，骨架含有重复的酰胺键结构，故可以使用固相合成方法合成寡聚物。

⑷ 通过将生物素、荧光素与合成的肽核酸序列进行连接形成带标记的特异性探针。

1.2 肽核酸同DNA和RNA的杂交特性

⑴ 由于PNA在杂交时具有的高度特异性，使得PNA-核酸杂交分子一旦出现错配，将大大降低其稳定性[6]。

⑵ 与DNA和RNA不同，肽核酸骨架是不带电荷的。这使得其具有比核酸杂交分子更高的热稳定性。Jensen等[7]发现PNA杂交分子所需的解链温度（Tm值）要比相应的核酸杂交分子高出许多。

⑶ PNA在与互补DNA或RNA序列杂交时，有两种结合方式：一种是采取与DNA分子相同的反向平行互补的方式进行杂交；一种则是通过正向平行互补的方式[8]。

⑷ DNA/DNA杂交分子的一大缺陷即是受盐离子浓度影响很大，只有在一定盐离子浓度条件下，DNA分子才能稳定存在。PNA杂交分子则不存在此问题，在盐离子浓度很低的条件下，PNA也仍可以与核酸分子稳定杂交[9]。

2 肽核酸的合成

由于肽核酸具有骨架呈电中性、生物稳定性较高、容易和DNA或RNA结合形成稳定的复合物等方面优点，近年来针对肽核酸修饰与合成的研究具有很高的热度。肽核酸本身的化学结构较为简单，故其合成方法并不繁琐。从结构上可知肽核酸是由许多肽核酸单体聚合而成的，所以合成它的重点在于单体的合成。

2.1 PNA骨架的合成

PNA单体主要由三部分组成，一是骨架部分，二是碱基部分，三是碱基和骨架的连接部分。其合成始于对N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架的合成，然后是对碱基的保护，最后将碱基与骨架进行连接。合成骨架的常用方法有3种[10]。

⑴ 以乙二胺或乙腈为原料，与卤代乙酸衍生物发生烷基化反应[11,12]，见图2a。

⑵ 还原保护的氨基乙醛和甘氨酸酯形成的席夫碱[13]，见图2b。

⑶ 利用带有叔丁氧碳基（t-Butyloxy carbonyl，Boc）保护的氨基乙醇与带有对硝基苯基甲磺酰基（o-NBS）保护的甘氨酸酯进行Mitsunobu反应合成PNA骨架[14]，见图2c。

图2 PNA单体骨架的合成

2.2 PNA单体的形成

结束骨架部分的合成，即可进行碱基的保护。由于5种核酸碱基中有些带有活泼氨基，故应先将其保护起来，才能使得烷基化反应发生在特定的没有保护的氮上，形成相应的碱基乙酸衍生物。常用的保护基团有苄甲氧碳基[11]（benzyloxycarbonyl，Cbz）、叔丁氧碳基（t-Butyloxy carbonyl，Boc）[15]等。

胸腺嘧啶和尿嘧啶不含有活泼氨基，故可以直接与卤代乙酸酯发生反应。胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤均含有活泼氨基，故需先对氨基基团加以保护后，才能使反应在期望的正确位置进行。三者中腺嘌呤和胞嘧啶的保护方法相似，均采用的是先对活泼氨基进行保护；再同卤代乙酸酯反应，生成相应的碱基乙酸酯；最后利用溶解于二氯甲烷中的三氟乙酸去除甲酯，得到所需的乙酸衍生物。鸟嘌呤的保护相对繁琐，需要排除N7烷基化副反应的干扰[10]。故常用的方法是以2-氨基-6-氯嘌呤为底物，烷基化反应后再将氯水解为碳基[16]（图3）。

图3 核酸碱基乙酸衍生物的合成

图4 碱基乙酸与PNA骨架相连

最后，参考多肽合成的方法，选取合适缩合剂将所得碱基乙酸衍生物同骨架上未保护的氮原子相连接，即可得相应的PNA单体[17]，见图4。

3 肽核酸的应用

正是由于肽核酸单体合成条件较为简单，步骤也较少，合成原料也价廉易得，故容易大量制备，并广泛应用于医药卫生领域。如：根据其不带电荷的特性设计合成的PNA探针，可以对食物中的病原微生物进行快速筛选检测[18]；也可以通过设计合成能够靶向病原菌相关致病基因的反义肽核酸序列，并与细胞穿膜肽进行连接，形成多肽-肽核酸重组序列（peptide-PNA, PPNA），其能够抑制病原菌的生长和相关致病基因的复制[19,20]。此外，肽核酸在肿瘤治疗和诊断领域也具有很高的研究价值。如：肽核酸能够调控与肿瘤发生相关基因、蛋白的表达从而达到抑制肿瘤增殖的效果；还可将其与放射性标记物或荧光基团结合从而实现对肿瘤的实时检测和诊断。以下4例为其在肿瘤免疫研究中的具体应用。

3.1 PNA可以抑制端粒酶活性

人类肿瘤里几乎均可检测到端粒酶活性，且其可能对肿瘤的增殖起着关键的作用。可以通过表达人源端粒的反义RNA互补产物来抑制端粒酶活性，从而起到抑制肿瘤细胞系端粒长度延伸的作用。

已有研究定性地检测到DNA寡核苷酸会与人源端粒RNA或纤毛虫端粒酶RNA互补从而抑制端粒酶活性。然而，DNA寡核苷酸容易被核酸酶降解而不太适用于在细胞粗提物和生物体中使用。因此需要一种高效且化学稳定的抑制剂。有研究表明，PNA同RNA或DNA会形成非常稳定的三螺旋结构[21]，故在选取抑制DNA或RNA酶活性的分子通道阻剂时常考虑使用PNA分子。Norton等[22]发现PNA寡聚体可以抑制端粒酶活性，其半抑制浓度(IC50)最低可低至900 pM。且因PNA具有选择性好、效率高等优点，故被认为是能够检测胞内端粒酶功能的有用化合物。

3.2 肽核酸-抗体结合物在肿瘤放射性检测和治疗的应用

传统的携带有放射性核素的肿瘤特异性单克隆抗体（mAbs），由于其具有较高的分子量而存在分子大小相关的生物透过障碍[23]，如：“外渗作用、肾小球过滤障碍”。故mAbs会在肿瘤位点逐渐积累，以致在血液中滞留数天[24]。在血液中缓慢的清除速率将会使得给药后的图像采集时间延长，而在非靶点组织的积累将会引起非肿瘤细胞的放射性损伤。肽核酸由于其在生物体内的高度代谢稳定性和较少的非特异累积而成为理想的癌症诊断和治疗候选物。Leonidova等[25]将未标记的，具有高度特异性的抗体-PNA结合物先行导入生物体内并靶向肿瘤细胞，随后再将带有放射性标记的互补PNA导入使其与抗体-PNA在肿瘤位点进行杂交，从而达到肿瘤定位效果。这一方法的优势在于使抗体-PNA结合物有充足的时间与肿瘤结合，并可以从非特异性结合位点上清除；而采用小型快速清除的放射标记则有效避免了其在血液中累积而产生细胞毒性。故该法在癌症的放射性检测及治疗领域有着巨大的潜力。

3.3 利用细胞渗透性的γ胍基肽核酸降低肝肿瘤细胞中的β-连环蛋白表达

在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中，许多异常激活的信号通路被鉴定出来，并成为富有吸引力的治疗靶点，Wnt/β-连环蛋白通路就是其中之一[26]。突变及失控的β-连环蛋白在肝癌发生中扮演重要角色[27]，在约30%的HCCs中，由于CTNNB1基因的exon-3上丝氨酸或苏氨酸编码碱基发生的点突变将会使得β-连环蛋白具有稳定而持续的活性。β-连环蛋白异常激活与肿瘤细胞的增殖和存活息息相关，使得其成为肝细胞癌患者亚群中的一个有效治疗靶点[28]。Delgado等[29]通过设计一种新型的细胞渗透型的γ胍基肽核酸（γGPNA）反义寡核苷酸，其能与β-连环蛋白基因的转录或翻译起始位点进行配对，从而降低β-连环蛋白在肝肿瘤细胞内的表达，影响肝肿瘤细胞的增殖和活力。此外，β-连环蛋白在肝癌细胞的下调也影响了一些血管生成因子的表达，这些因子会引起HCC相关内表皮细胞的小管形成和管腺增生减少，因此γGPNA在HCC治疗方面有着重要的意义。

3.4 利用合适的PNA分子信标检测活细胞及结肠组织腺癌内的长链非编码RNA(CCAT1)

大肠癌（colorectal cancer，CRC）的演进很大程度上取决于基因改变的积累。过去几年，非编码RNA在基因表达和调控以及在肿瘤发生中的功能引起了科研工作者的关注。有研究表明长链非编码RNA（lncRNA）在细胞增殖和入侵方面具有潜力，一些lncRNA在癌症组织和癌症细胞系中过表达，而另一些则和较差的癌症预后以及转移相关。Nissan等[30]鉴定了大肠癌相关转录子-1（CCAT-1）在CRC和正常组织中高度表达，由于CCAT1在大多数初始CRC肿瘤中是上调表达的，所以它可以作为一种实时体内成像的有效靶标。

为了检测广泛的结肠癌，Kam等[31]进一步设计PNA分子信标（PNA-MBs）从而使其不仅靶向体细胞突变，而且靶向结肠癌以及腺瘤内上调的细胞内转录本，如：CCAT1，lncRNA。所有染色腺瘤和腺癌与K8-180-TOPNA-MB孵育后，均有较强的荧光，而同一病人的正常组织与其进行孵育后则荧光强度减弱很多。这与之前证实CCAT1在腺瘤和癌中高表达而在正常结肠粘膜组织上低表达的PCR数据一致，这表明PNA-MBs在临床上可以被用于实时鉴别腺瘤和良性息肉，如增生性息肉或错构瘤，而其高度的敏感性则将可以快速和简单地对病变部位进行活检。

4 展望

自肽核酸于1991年由Nielsen等在实验室成功合成以来，由于其独特的杂交特性与优良的生物稳定性而倍受研究者的青睐。经过近三十年的发展，PNA的合成及其应用正在逐步走向成熟。在合成方面，对其经典结构的合成已经较为成熟，而针对其经典结构改造与修饰的研究也层出不穷，改造主要集中于对PNA骨架的修饰[32-34]、改变碱基与骨架的联接位置与方式[35-37]、对碱基的替代三方面。通过对PNA进行修饰和改造，使其细胞摄取率与细胞内靶向性得到提升。

由于PNA具有很高的序列杂交特异性以及对于错配碱基的分辨能力，故利用其开发新型诊断探针和调控基因表达仍将是其未来的主要研究方向之一。此外，还可以利用PNA结构简单易合成的特性，尝试合成一些以其为底物的小分子药物，如：cGAMP、cGMP、cAMP的肽核酸类似物，再将其用于细胞免疫测试，观察其对于cGAS-STING[38]等信号通路的调节作用，若具有一定增强或抑制活性，则有望开发出新型的免疫制剂。