张雯琼，金春明，尹贵彬

(牡丹江医学院附属红旗医院检验科，黑龙江 牡丹江 157011)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性的身心健康[1]。我国并不是乳腺癌的高发国家，但近几年我国乳腺癌发病率的增长速度逐渐超过许多高发国家[2]。有研究表明，我国乳腺癌的发病率正以每年2%左右的速度递增[3]，特别对于城市女性，乳腺癌所致的疾病负担日益加重[4]。乳腺癌早期没有明显的症状和体征，当患者出现明显的临床表现时已经处于乳腺癌的中期或晚期，因此往往会错过乳腺癌的最佳治疗时期。所以，研究乳腺癌相关的分子生物标志物对于乳腺癌的早期诊断与治疗具有重要意义。近年来，随着对非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的研究，环状RNA(circular RNA，circRNA)与长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)也逐渐出现在人们的视野之中。CircRNA是一种特殊的ncRNA，与线性RNA不同的是，它没有5′端帽子结构，也没有3′端多聚A尾结构，而是5′端与3′端直接相连形成一种闭合环状的特殊结构[5]。由于circRNA有其特殊的广泛性，稳定性，保守性等特征并存在于真核生物细胞质中，有望成为肿瘤早期诊断的分子生物标志物。有研究表明circPVT1在许多肿瘤的发生发展中都起着重要作用，但关于circPVT1在乳腺癌中的表达的报道比较少见。而lncRNA也有报道显示在一些肿瘤中可作为新的分子生物标记物和潜在治疗靶点，其中lncGAS5在癌症中起着抑癌作用。本研究是为了探讨circPVT1与lncGAS5及其比值在乳腺癌中的表达及评估，为乳腺癌的早期诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018年1月至2019年7月在牡丹江肿瘤医院治疗的60例乳腺癌患者中乳腺癌组织、癌旁组织及其相应血清样本和牡丹江医学院附属红旗医院60例体检中心正常女性的对照血清样本。所有乳腺癌患者均通过病理确诊为原发性乳腺癌，均为女性，年龄在35～80岁，平均(53.6±10.2)岁。根据AJCC分期，Ⅰ期患者14例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期患者9例，Ⅳ期患者6例。所有患者术前均未经放化疗治疗。

1.2 主要试剂与仪器Trizol RNA 提取试剂购于美国Invitrogen公司，Master Mix试剂盒购于德国Roche公司，反转录试剂盒购于美国Thermo公司，实时荧光定量PCR仪(ABIQ6)购于美国APPlied Biosystem Inc 公司，PCR引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 组织中circPVT1与lncGAS5水平检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织circPVT1与lncGAS5表达情况。①标本收集与保存：收集乳腺癌癌组织与相应的癌旁正常组织于EP管中，并保存于-80℃冰箱中备用；②Trizol法提取组织中总RNA；③用反转录试剂盒获取cDNA；④qRT-PCR检测：采用qRT-PCR仪对circPVT与lncGAS5进行扩增，以β-Actin为内参。反应体系：正、反引物(10μmol/L)各0.5μL,2×Master Mix5.0μL，cDNA(50 ng/μL)1.0μL，qRT-PCR试剂盒中水2.0μL，共9μL。反应条件设置如下：95℃10min，95℃15s，60℃60s，共45各循环。反应结束后，采用 2-ΔΔCT法对circPVT1和lncGAS5在样本中的相对表达量进行分析。

1.3.2 血清中circPVT与lncGAS5水平检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清circPVT1与lncGAS5表达情况。①标本收集与保存：抽取外周静脉血3mL，3000r/min离心10min，保留上清液与EP管中，并保存与-80℃冰箱中备用；②Trizol法提取血清中总RNA；③从用反转录试剂盒获取cDNA至qRT-PCR检测全部步骤同“1.3.1”。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析数据和GraPhPad Prism进行图像绘制。计量资料用中位数(M)及四分位间距(QR)表示,组间比较采用配对的非参数检验，两个独立样本Wilcoxon W非参数检验和多个独立样本Kruskal-Wallis非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织中circPVT1与lncGAS5水平circPVT1在乳腺癌组织中的表达量高于癌旁组织；lncGAS5的表达量在乳腺癌组织中处于低表达。差异有统计学意义(P<0.001),见图1、图2。

图1 乳腺癌组织与癌旁组织中circPVT1水平比较

注：Breast cancer tissue：乳腺癌组织；Paracancerous：癌旁组织；Relative circPVT1 expression：circPVT1水平比较

图2 乳腺癌组织与癌旁组织中lncGAS5水平比较

注：Breast cancer tissue：乳腺癌组织；Paracancerous：癌旁组织；Relative lncGAS5 expression：lncGAS5水平比较

2.2 乳腺癌患者血清与健康对照者血清中circPVT1与lncGAS5水平circPVT1在乳腺癌血清中的表达量高于健康对照血清；GAS5的表达量在乳腺癌血清中处于低表达。差异有统计学意义(P<0.01)，见图3、图4。

图3 乳腺癌患者血清和健康对照者血清中circPVT1水平比较

注：Breast cancer serum：乳腺癌血清；Normal serum：健康对照血清；Relative circPVT1 expression：circPVT1水平比较

图4 乳腺癌患者血清和健康对照者血清中lncGAS5水平比较

注：Breast cancer serum：乳腺癌血清；Normal serum：健康对照血清；Relative lncGAS5 expression：lncGAS5水平比较

2.3 各期乳腺癌患者circPVT1/lncGAS5的水平circPVT1与GAS5的比率与乳腺癌的分期有关，差异有统计学意义(P<0.0001),见图5。

图5 circPVT1/lncGAS5在乳腺癌不同分期的表达量

注：ratio of circpvt1/lncGAS5：circPVT1/lncGAS5的表达量

2.4 乳腺癌组织中circPVT1与lncGAS5与乳腺癌临床病理特征关系淋巴结有无转移中circPVT1表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；淋巴结有无转移、AJCC不同分期中lncGAS5的表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；circPVT1与lncGAS5与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小和肿瘤的部位无明显相关性(P>0.05)，见表2。

表2 组织中circPVT1、lncGAS5与乳腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

随着分子生物学技术在RNA研究中的应用与发展，已有大量的circRNA与lncRNA被人们所认识，但对于circRNA与lncRNA的作用机制还不是特别明确，进一步的研究还属于起步阶段。

本文探讨的circPVT1是由PVT1基因的初始转录本中的一个外显子环化形成的一种circRNA，位于染色体8q24上拥有癌症易感位点和两个内含子侧翼(35269bP和41466bP)，还包括许多Alu重复序列[6]。Panda[7]等人发现circPVT1是一个与衰老相关的circRNA，在人二倍体WI-38细胞中呈低表达并通过调控let-7影响靶基因来抑制衰老。Chen[8]等人在研究胃癌组织及其相应的癌旁组织中发现，circPVT1在胃癌组织中呈高表达并且还用过分子海绵作用miRNA-125家族来促进细胞的增殖。circPVT1的水平被认为是一个在胃癌中独立的预后指标。也可以说circPVT1是胃癌中的一种新的增殖因子和预后标志物。但是circPVT1在乳腺癌中的关联还没有相关报道显示，本研究结果显示circPVT1在乳腺癌中呈现高表达。生长阻滞特异转录本 5(GAS5)是一种抑癌基因，该基因编码的染色体位点是1q25。Mourtada 等[9]发现乳腺癌组织标本中 lncGAS5 水平显著低于正常乳腺上皮组织，同时，lncGAS5 的表达水平与乳腺癌细胞的增殖呈负相关。还有研究表明lncGAS5 过表达还可增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，诱导细胞凋亡。但对于circRNA与linRNA在乳腺癌中的联合检测和两者之间的比值在乳腺癌中的表达还没有相关报道。本研究结果显示，lncGAS5在乳腺癌中呈低表达，并且circPVT1与lncGAS5的比值与乳腺癌的分期呈正相关。

CircRNA从最开始被人们认为是“垃圾分子”，到如今被证实广泛存在真核生物中，并逐渐被人们所认识，这个过程是漫长的。但由于circRNA有其特殊的广泛性，稳定性，保守性等特征也因此吸引了更多研究者对它进行研究。大量研究表明，circRNA在肝癌[10]、乳腺癌[11-13]、胃癌、肺癌等的发展进程中有着一定的作用。还有研究报道，linRNA在乳腺癌[14-21]的预防、诊断、治疗等方面也具有广阔的应用前景。但是linRNA作为生物标记物或是新的肿瘤治疗手段仍然没有得到更加广泛的应用，其中巨大的挑战是准确寻找临床治疗的靶点及其目标基因，并能全面了解它们的相互作用。为此，更加先进的分子生物学技术、更加完善的体外体内试验应该更多地应用于乳腺癌等肿瘤相关linRNA的基础和临床研究中，从而找出更多与乳腺癌发生、转移、耐药相关的linRNA，深入了解其靶基因和相关作用机制，并在此基础上开发特异的治疗药物，实现有效杀灭肿瘤细胞，减少肿瘤的复发，增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性等目标。

综上所述，circPVT1与lncGAS5及其比值在乳腺癌中的辅助诊断是有价值的，有望成为乳腺癌早期诊断的潜在分子生物标志物。