郭 楠，王庆玮，罗贤臣，倪观太

(皖南医学院第一附属医院弋矶山医院妇产科，安徽 芜湖 241001)

子宫颈癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，在全世界女性恶性肿瘤中发病率排第3[1]，在我国每年有9.89万左右的新增加的宫颈癌病例数，且近些年有越来越多的年轻女性罹患宫颈癌。手术、放疗、化疗在治疗宫颈癌中发挥了关键作用，然而这些方法带来的相关副作用决定了其仍然存在一定的局限性。早期宫颈癌经治疗后5年生存率较高，但晚期宫颈癌患者的预后以及生活质量仍不理想，这严重威胁了全球女性的身心健康。故深人探索宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌获得早期治疗的新靶点十分重要。

B细胞特异性莫洛尼小鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1,BMI1)基因编码无名指蛋白，其位于10号染色体上[2]，是一种通过调节染色质结构来介导基因沉默的聚梳抑制因子复合物1(Prc 1)的成员[3-4]。它是神经干细胞自我修复和神经祖细胞在成体组织内增殖的有力诱导剂[5]，调控多种疾病过程，对细胞增殖、分化、自我更新和对多种抗癌药物的耐药等方面发挥着重要作用。本研究通过在宫颈癌HeLa细胞系敲减BMI1基因后进行体外细胞功能实验，研究敲减BMI1后对于宫颈癌细胞的各种基本生物功能产生的影响，以判断是否可作为宫颈癌治疗及预后判断的新靶点。

1 材料和方法

1.1 标本收集于皖南医学院弋矶山医院妇科收集正常新鲜宫颈组织及宫颈癌组织各10例。所有组织标本均在离体后尽快置于-80℃冰柜中保存。宫颈癌患者年龄39～64岁，平均(46.8±7.2)岁，对照组的年龄在44～65岁，平均为(53.0±7.8)岁。

纳入标准：①原发性宫颈癌患者；②术前无激素治疗、放射治疗或化疗的病史；③所有患者均经皖南医学院第一附属弋矶山医院病理科证实；④对照组选择同病例对照或同期经检查无癌症的患者。排除标准：①合并其他癌症；②经过治疗的患者。

1.2 细胞与试剂从中国科学院细胞库购入人宫颈癌HeLa细胞株。1640培养基、胎牛血清从赛默飞世尔公司购买。cDNA试剂盒及qPCR试剂盒于天根公司购买，引物、转染试剂购于锐博公司。Transwell小室于康宁公司购买。Matrigel基质胶购自碧迪公司，CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于贝博公司。

1.3 细胞培养与siBMI1转染将HeLa细胞接种于1640培养基，内含10%胎牛血清，在温度37 ℃、饱和湿度及5%CO2的培养箱中繁育，适当换液及传代。取对数生长期的细胞用于实验，选择状态良好的细胞，按每孔2～3×105细胞接种于6孔板中，当细胞生长30%～50%时，分别用siBMI1及siNC转染HeLa细胞。

1.4 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)将收集的宫颈正常组织及宫颈癌组织充分研磨，利用Trizol试剂按照说明书提取总RNA，选择那些经证实完整性较好的RNA用于后续实验。根据FastQuant cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录。并利用ABI7500实时定量PCR仪检测BMI1 mRNA的表达量。SYBR Green反应体系为20μL。利用2- △△Ct法计算BMI1 mRNA的相对表达量。

1.5 CCK8实验取对数期生长的 HeLa 细胞进行转染，后以每孔3×103细胞数种植到96孔板中，每组设3个复孔。0、24、48、72h后每孔分别加入10μLCCK8试剂，培养箱孵育3h后，酶标仪450nm的波长范围检测光密度值(OD值)。重复检测3次，检测敲减BMI1后细胞的增殖能力有何变化。

1.6 细胞划痕实验转染24 h后分别收集两组细胞，以每孔5×105细胞数种植于6孔板，待其几乎长满时，用10μL枪头在6孔板内垂直画线，2遍PBS洗涤后加入低血清1640培养基，24 h后于倒置的显微镜下观察拍照。

1.7 Transwell实验取出24孔板，将Matrigel基质胶按说明书稀释后平铺入Transwell小室，将500μL含20%胎牛血清的1640培养基缓慢加入下室，玻璃管收集siBMI1转染24 h后的细胞，以无血清1640培养基重悬，每孔5×105/mL的细胞悬液200μL接种于小室上室。24h后，沾有少量PBS的棉签擦拭Transwell小室膜的上层，4%多聚甲醛固定30min，0.1%结晶紫染料染色20min，蒸馏水冲洗数次。于倒置显微镜下观察，计数出Transwell小室被结晶紫染色的细胞数目，即代表穿过小室膜的细胞数目的多少，以此说明侵袭能力高低。各样本均选择相对平均的5个视野，分别计数出各细胞个数，最后得出平均值。

1.8 细胞凋亡实验分别收集两组细胞，加入5μL Annexin V-FITC，4℃，避光孵育15min，接着加入5μL PI，4℃，再次避光孵育5min。上机，流式细胞仪分别测出两组细胞的凋亡率。

1.9 统计学方法采用GraphPad软件进行作图及统计分析。“均数±标准差”来表示计量资料，进行独立样本t检验和卡方检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMI1在宫颈癌组织中表达增高qRT-PCR结果表明与正常宫颈组织相比，BMI1 mRNA在宫颈癌组织中表达量增高明显(P<0.05)。(图1)。

图1 BMI1在正常宫颈组织及宫颈癌组织中的表达(P<0.05)

2.2 敲减BMI1对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响细胞转染24h后，通过qRT-PCR验证敲减效率，结果显示，转染后siBMI1表达较对照组显著降低(P<0.05)。(图2)。通过CCK8实验来检测BMI1敲低后对于细胞增殖水平的影响。 CCK8结果得出BMI1敲低后可有效抑制HeLa细胞的增殖能力(P<0.05)。(图3)。

图2 转染后两组细胞BMI1的表达量(P<0.05)

图3 敲减BMI1抑制HeLa细胞的增殖(P<0.05)

2.3 敲减BMI1对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响将画线区域的细胞间距进行比较，发现与对照组比较，实验组细胞的划痕宽度较之缩短，愈合能力降低明显(P<0.05)，表明实验组细胞的迁移能力受到抑制。(图4) 。

图4 敲减BMI1抑制HeLa细胞的迁移(×100，P<0.05)

2.4 敲减BMI1对宫颈癌HeLa细胞侵袭的影响实验组相较于对照组可见，细胞的染色数目减少明显(P<0.05)，差异有统计学意义。(图5)。

图5 敲减BMI1抑制HeLa细胞的侵袭(×100,P<0.05)

2.5 敲减BMI1诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡流式细胞术用来检测BMI1敲减后对于HeLa细胞凋亡的影响。结果显示凋亡率在对照组为 (1.69±0.70)% ，在实验组为(4.89±0.30) %，表明敲减BMI1明显诱导了HeLa细胞的凋亡。(图6)。

图6 敲减BMI1诱导HeLa细胞的凋亡(P<0.05)

3 讨论

宫颈癌的发生发展是一个多因素、多步骤参与的复杂过程[6-7]。近些年新兴的分子靶向疗法为癌症的治疗带来了新的曙光，找到有效的致瘤靶点并研发出可与之结合的药物是目前的研究热门。

BMI 1是一种能在体外和动物模型系统中诱导细胞转化和促进肿瘤生长的癌基因[8-9]。大量研究表明，BMI1的过度表达在许多癌症中与疾病的晚期分期、侵袭性临床病理行为及放化疗的不良预后有关[10]。它是促进前列腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、胶质瘤等发生的癌基因[11-15]。研究表明BMI1基因敲除可导致异种移植瘤的生长和浸润减少[16]，并增加对细胞毒性药物的敏感性[17]，这些均提示BMI1在细胞增殖、肿瘤发生和恶性进展中发挥了基础作用。

结合本研究，qRT-PCR结果发现BMI1 mRNA在宫颈癌组织中的表达较正常宫颈组织明显增高，我们在宫颈癌HeLa细胞系中进行体外相关实验。BMI1敲减后检测宫颈癌HeLa细胞的增殖能力、侵袭能力、迁移能力和凋亡能力。实验结果表明了BMI1敲减后可使宫颈癌HeLa细胞的增殖力下降，侵袭、迁移能力受到明显抑制，细胞的凋亡率显著升高。由此可见，BMI1在宫颈癌的不断进展过程中发挥着促癌基因的作用，敲减BMI1降低了宫颈癌HeLa细胞的恶性行为能力，其有可能抑制宫颈癌的发展，成为宫颈癌靶向治疗的一个新方向。但因为只使用了单一的细胞系，实验结论方向较为单一，需要进一步增加其它宫颈癌细胞系进行体外实验及体内实验进一步验证。