王玉祝，余 洋，高 静*，王 刚

(1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013； 2. 上海市第八人民医院药剂科，上海 200235)

盐肤木(RhuschinensisMill)为漆树科盐肤木属植物，别名五倍子树，为中药大辞典收载的传统中药[1]。在我国部分地区作为治疗癌症的中草药[1]。蚜虫寄生在盐肤木叶上后可以刺激叶组织细胞增生，形成虫瘿，成为五倍子[2]。以根、叶入药，有清热解毒、散瘀止血之功效[3]，主治支气管炎，咳嗽咯血，肠炎，痢疾。已知盐肤木含有黄酮类[4-6]、酚酸类[5-9]、鞣质[6]、脂肪酸[7]和三萜类[5, 6, 8]等成分，有抗病毒，抗菌，抗氧化，抗肿瘤等作用[10-14]，本课题组对盐肤木根茎进行有效成分研究时发现盐肤木根茎富含三萜酸。本实验采用RP-HPLC法，对其中明确的两种三萜酸-桦木酸、桦木醇进行了测定。本研究建立了分离效果好、专属性强的高效液相色谱法测定其中的两种三萜酸的方法，结果满意，可作为盐肤木根茎中三萜酸质量控制的指标之一。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桦木酸(Betulinic acid，98%)、桦木醇(Betulin，98%)购于上海歆睿有限公司；乙腈和甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)，水为自制重蒸馏水；其它为分析纯；盐肤木根茎购自同仁堂药房，经江苏大学杨欢教授鉴定为盐肤木(R.ChinensisMill)。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)； AL204电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；DL-720A超声清洗仪(上海市之信仪器有限公司)；RE-53AA旋转蒸发仪(上海贤德实验仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

Hypersil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水-磷酸(89:10:1)；柱温:室温;进样量: 20 μL；体积流量: 0.8 mL·min-1；灵敏度: 1.00 AUFS；检测波长: 205 nm。

在上述色谱条件下，对照品及供试品色谱图见图1。

图1 对照品和盐肤木样品的HPLC图Fig 1. HPLC chromatogram of reference substance and R. Chinensis Mill sample注：A.对照品 B.盐肤木样品 1. 桦木酸 2.桦木醇

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品桦木醇5.22 mg、桦木酸5.46 mg，以流动相定容至100 mL作为对照品储备液，备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

将盐肤木粉碎过80目筛，用乙醇回流提取，控制温度，加热提取5 h后超声1 h，抽滤，然后50℃减压浓缩滤液，重复2次，合并浓缩液。浓缩液分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇进行萃取。二氯甲烷萃取部分300～400目硅胶拌样，干燥后，采用湿法装柱，从二氯甲烷：甲醇50∶1开始进行梯度洗脱，15∶1部分得到样品。

2 结果与分析

2.1 桦木酸、桦木醇提取工艺的考察

影响桦木酸、桦木醇提取率的主要因素：料液比(A)、乙醇浓度(B)以及提取温度(C)，试验因素水平安排见表1。结合文献和预实验结果，以上述3个因素为主要考察因素，每个因素设立3个水平，采用L9(34)正交设计，以盐肤木提取物中的桦木酸、桦木醇含量为指标进行综合加权评分，按下列公式进行计算：综合得分=桦木酸含量得分×50%+桦木醇含量得分×50%，考察各因素对提取效率的影响，优选桦木酸、桦木醇的提取工艺，试验结果见表2。 因素A、C对桦木酸、桦木醇的提取有显著性影响，通过方差比较可以影响提取效果的主次因素依次是A>C>B，可以得到A2B1C2为最优的组成及工艺，即: 采用料液比为1∶20(1 g药材加入20 mL乙醇)，乙醇浓度为60%，提取温度为50℃为最佳工艺。

表1 试验因素水平表

表2 L9(34)正交试验结果及综合评分

表3 试验方差分析表

注：*差异显著，P<0.05。

2.2 线性关系考察

精密吸取2.2中对照品储备液1、3、5、7、10 mL，分别用流动相定容至10 mL容量瓶中，摇匀。分别精密吸取上述标准系列溶液20 μL。在上述色谱条件下测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，以样品质量浓度为横坐标，进行线性回归，桦木酸、桦木醇的线性回归方程依次为：Y=57487X+38647、Y=64932X+45671 ，线性范围分别为5.2～52 μg·mL-1、10.8～108 μg·mL-1，相关系数分别为0.9996，0.9995。

2.3 精密度试验

精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样5次，以峰面积计算，桦木酸、桦木醇的RSD分别为1.6%、0.9%(n=5)。

2.4 重复性试验

精密称取同一批次盐肤木样品5份，每份约10 g，按2.3项方法进行操作，制得5份供试品试液。按2.1色谱条件分别进样，样品中含有桦木酸、桦木醇的量分别为0.014%、0.106% (n=5)，RSD为0.6%、0.9%(n=5)。

2.5 稳定性试验

取同一批次供试品溶液，按2.1色谱条件，分别在1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 h进样，测定各成分的质量分数，样品中桦木酸、桦木醇的RSD分别为1.2%、0.9%(n=5)。说明3成分的乙醇溶液在12 h内稳定。

2.6 加样回收率试验

精密量取已知含量盐肤木5份，每份1 g。向每份样品分别加入桦木酸、桦木醇标准品各2 mg。按2.3项方法进行操作，最后将提取粉末用甲醇定容至10 mL容量瓶中，制得5份加标溶液，分别进样20 uL，结果得到桦木酸、桦木醇的平均回收率分别为99.3%、99.0%，RSD分别为0.8%、1.0%。

2.7 样品测定

精密吸取供试品溶液20 μL注入HPLC仪，重复进样3次，记录色谱图按外标法以峰面积计算，测定制备的盐肤木样品，样品中3成分结果见表4。

表4 盐肤木样品中桦木酸和桦木醇的测定结果

3 结论与讨论

3.1 萃取试剂的选择

桦木酸、桦木醇为五环三萜类化合物，用乙醇回流方法进行粗提后采用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，其中以石油醚部位含量最高，故最终采用石油醚萃取。

3.2 检测波长的选择

分别取桦木酸、桦木醇对照品溶液，在紫外分光光度计上进行扫描,各对照品均在205 nm处有最大吸收，在其他波长处无吸收，因此选205 nm作为检测波长。

3.3 色谱条件的选择

取桦木酸、桦木醇两种对照品混合溶液，进样分析。色谱柱采用Hypersil- C18柱(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)，根据参考文献[15]，采用甲醇-水系统为流动相时，样品不能完全分离，且由于甲醇末端吸收较强，基线不平稳；之后采用乙腈-水系统，分离度很好，加入0.1%磷酸后峰形有所改善。因此最终采用乙腈-水-磷酸(89∶11∶0.1)为流动相。由于预实验中发现室温下三萜类成分出峰时间较靠前，设置流速为0.8 mL·min-1后，出峰时间后移，且杂质减少，因此，最终采取实验方案所选择的色谱条件。

盐肤木三萜部分具有明显的药理活性。本实验通过对盐肤木中两种三萜酸的测定，可作为盐肤木质控指标。