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5种石油醚前处理对不同植物样品黄酮含量测定的影响

2017-08-29郑定华袁淑娜陈俊明黄坚雄

热带农业工程 2017年2期
关键词:干扰提取

郑定华++袁淑娜++陈俊明++黄坚雄++潘剑++李娟++周立军

摘 要 为了解不同石油醚前处理对植物黄酮含量测定的影响,用70 %乙醇提取、芦丁硝酸铝亚硝酸钠比色法,对经过5种石油醚前处理的不同植物样品中黄酮含量进行比较研究,结果表明:经石油醚索氏回流前處理的样品提取液颜色较浅且沉淀较少;先提取再石油醚萃取处理的各样品黄酮含量测定值均异常高于其他4种处理;经CK、石油醚超声30 min、石油醚浸泡15 h前处理的乌蕨、广金钱草样品黄酮得率均有所提高,但地胆头和鸡骨草则有升也有降;进一步检验分析发现,若待测液有未除尽的石油醚,则会而造成测定值偏高。结论:石油醚前处理未必能提高植物样品黄酮得率,也不会造成黄酮的显著损失,在一般的植物黄酮含量测定中其并非必要程序,但若采用了该程序则应在黄酮含量测定前除去待测液中余存的石油醚以排除干扰。

关键词 石油醚 ;植物黄酮 ;提取 ;黄酮含量 ;干扰

中图分类号 TS224.4

Effects of Five Petroleum Ethers Pretreatment on

Different Plant Samples Flavonoid Content

ZHENG Dinghua YUAN Shuna CHEN Junming HUANG Jianxiong

PAN Jian LI Juan ZHOU Lijun

(Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Danzhou Station for Tropical Crops Investigation & Experiment, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737)

Abstract In order to find out the effects of different petroleum ether pretreatment on the content determination of plant total flavonoid,four plant samples pretreated by five different petroleum ether treatments were studied in this paper. Results showed that extracts (70 % ethanol extract, the same blow) from samples pretreated by heating reflux with Soxhlet extractor (CK) showed lighter color, deposit was easier found in extracts with no petroleum ether treatments. All of the petroleum ether pretreatment after extraction showed abnormally higher total flavonoid content than CK, no petroleum ether treatments, petroleum ether pretreated 30 min by ultrasonic, and petroleum ether pretreated 15 h by Cold-soak. Total flavonoid content of Stenoloma chusanum and Desmodium styracifolium that pretreated by CK, petroleum ether pretreated 30 min by ultrasonic, and petroleum ether pretreated 15 h all showed higher total flavonoid content than that of no petroleum ether treatments, but Elephantopus scaber and Aburs cantoniensis showed higher or lower. Further analysis found that residual petroleum ether in the extract may interfere the determination value of flavonoids. Conclusions: Petroleum ether pretreatment did not necessarily helpful or cause significant loss for plant flavonoid extraction, so it was not a necessary procedure in plant flavonoid determination, but if petroleum ether pretreatment were carried out, petroleum ether must be clean out before determination.

Key words petroleum ether ; plant flavonoid ; extract ; flavonoid content ; interfere

黄酮类化合物是广泛存在于植物中的一类重要的次生代谢产物,种类繁多且结构复杂。植物黄酮类成分具有保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、保护心血管等多种药理活性,是植物和医药领域的研究热点[1]。黄酮提取是植物黄酮含量测定的基础,提取前一般先对植物样进行除杂处理。石油醚可破坏植物蜡质层和溶解油脂、叶绿素、胡萝卜素等[2-6],且一般黄酮类化合物不溶于石油醚中[7],因此,植物黄酮的提取一般可用石油醚进行脱脂。有研究指出石油醚前处理可提高植物黄酮得率[2,3,8],但有部分研究略去该程序[9-12]。石油醚前处理究竟会不会对植物黄酮含量的测定产生影响?笔者鲜有发现针对性的比较研究。基于此,本研究用70 %乙醇提取、芦丁硝酸铝亚硝酸钠比色法,对分别经过5种不同石油醚前处理的4种植物样品中黄酮含量进行了比较研究,以期探讨不同石油醚前处理对植物黄酮含量测定的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

地胆草根茎混合样、广金钱草叶片样、鸡骨草地上茎叶混合样、乌蕨地上部绿叶。均2016年10月采自中国热带农业科学院橡胶研究所橡胶林下间作试验基地。

仪器:日本岛津AUW220D电子天平,南方力劲机械有限公司超声波清洗机NK-C0112,索氏提取器,上海天美UV-1102分光光度计,磁力搅拌器,上海一恒HWS-26电热恒温水浴锅,上海安亭科学仪器厂TDL-5-A离心机。

试剂:沸程60-90 ℃石油醚,乙醇,NaNO2,Al(NO3)3,NaOH;芦丁标样购自中国食品药品检定研究院(纯度92.6 %)。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理及黄酮提取

设5个处理,4次重复。精密称取植物样粉末,乌蕨样约1 g,其他样约2 g,5个处理为:(1)石油醚索氏回流处理(CK):样品滤纸袋包好,置索氏提取器中加70 mL石油醚,75 ℃回流2 h,弃石油醚,样品滤纸袋热挥干石油醚,再置索氏提取器中,加入80 mL 70 %乙醇,96 ℃回流提取6 h,转出提取液,晾凉后用70%乙醇定容至150 mL,静置;(2)无石油醚处理:样品用滤纸袋包好,置索氏提取器中,后续70 %乙醇索氏提取步骤同处理(1);(3)石油醚超声30 min处理:样品滤纸袋包好放试管中加50 mL石油醚,密塞,整批40 KH 600 W超聲处理30 min,弃石油醚,滤纸袋热挥干石油醚,再置索氏提取器中,后续70 %乙醇索氏提取步骤同处理(1)。(4)石油醚浸泡处理:样品用滤纸袋包好,放试管中加50 mL石油醚,密塞浸泡15 h,弃石油醚,滤纸袋热挥干石油醚,后续70 %乙醇索氏提取步骤同处理(1)。(5)先提取再石油醚萃取处理:从处理(2)定容后的提取液中,精密量取10 mL提取液至试管中,加5 mL石油醚震荡,静置12 h后分层(经过对比观测萃取前后液面分层线均无变化),弃上层,得下层提取液。

分别量取各样品提取液约8 mL,置离心管中,5 000 rpm离心10 min,得上清液,待测。

1.2.2 芦丁标准曲线

精密称取芦丁标样0.021 6 g,溶于70 %乙醇,定容至100 mL,得0.2 mg/mL标准液。按以下步骤标定:(1)取10 mL容量瓶7个;(2)分别加入0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL芦丁标准液;(3)加5 % NaNO2溶液1 mL,摇匀后静置6 min;(3)加10 % Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀后静置6 min;(4)加4 % NaOH溶液4 mL;(5)70 %乙醇定容至10 mL,摇匀,静置10 min;(8)以508 nm测定吸光值(经波长扫描确定508 nm)。得标准曲线y=0.062 8 x+0.000 4,R2=0.999 1。

1.2.3 提取液黄酮含量测定

精密吸取1 mL样品提取液,置10 mL容量瓶中,按1.2.2中(3)-(8)程序测定,计算黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 5种石油醚前处理后样品提取液颜色差异

由表1可知,经石油醚索氏回流前处理的各样品,黄酮提取时索氏提取管中的初始提取液颜色均比其它4种处理的颜色要浅,其中鸡骨草样品变化最明显;未经石油醚前处理的鸡骨草、广金钱草各样品的黄酮初始提取液颜色均明显深于其它4处理,其中鸡骨草样品变化最明显;不同处理的植物样提取液经定容静置后,最终提取液颜色由深至浅分别为鸡骨草、乌蕨、广金钱草、地胆头,且提取液颜色越深越容易出现沉淀物,无石油醚处理的鸡骨草最终提取液沉淀最明显;除广金钱草以外,同一植物样经石油醚索氏回流处理(CK)后其最终提取液颜色要比其他处理浅,其他4个处理的颜色差别不明显。

2.2 5种石油醚前处理对样品黄酮含量测定的影响

由表2可知,鸡骨草、乌蕨的黄酮含量较高,广金钱草、地胆头的黄酮含量相对较低;处理(5)中地胆草、广金钱草、乌蕨的黄酮相对得率分别为240.77 %、212.87 %、179.02 %,均极显著高于其对应的另外4处理,鸡骨草的黄铜相对得率与其另外4处理间差异未达到显著水平,但相对得率达到126.02 %;经CK、无石油醚处理、石油醚超声30 min、石油醚浸泡15 h处理的黄酮含量未达到显著水平,其中经CK、石油醚超声30 min、石油醚浸泡15 h处理后,乌蕨、广金钱草样品的黄酮得率均比其未经石油醚处理的得率有所提高,提高幅度分别为6.82 %-7.42 %、8.83 %-12.00 %,而地胆头和鸡骨草表现为有处理提高而有处理却稍有下降。

2.3 石油醚干扰黄酮含量测定的进一步检验

针对处理(5)中各植物样黄酮含量均异常高于其另外4种处理的情况,可能处理(5)所得提取液中余存的石油醚对黄酮含量测定造成了干扰,因此,以石油醚前处理相对较为充分的CK处理所得各样品提取液及70 %乙醇和石油醚为测试材料,分别再经石油醚萃取(V石油醚:V提取液=1:2,下同)、石油醚萃取+水浴蒸干+70 %乙醇再定容至原体积等处理后,按1.2.3测定吸光值,结果见表3和表4。

由表3可知,石油醚在不添加任何试剂的情况下直接加注至比色皿,508 nm波长测得吸光值为-0.006 8;把石油醚作为待测液按黄酮含量测定的步骤依次加入各试剂并定容静置10 min后,开始分层,下层溶液虽未呈现任何红色螯合物特征反应,但有少量白色悬浊现象,其吸光值为0.494 2,均高于地胆头、广金钱草、乌蕨的黄酮含量测定的吸光值(表4);石油醚与70 %乙醇溶液按1:2体积混合分层萃取后,下层乙醇溶液再按1.2.3测得的吸光值为0.014 1。

由表4可知,CK处理所得各样品待测液经石油醚再萃取后,4种植物样提取液的吸光值均高于其CK处理的原吸光值,其相对值分别为167.44 %(地胆头)、131.76 %(广金钱草)、109.30 %(乌蕨)、101.58 %(鸡骨草),其中,地胆头、广金钱草均极显著高于其原吸光值;而经石油醚萃取+热蒸干+再定容后的处理,各样品测得的吸光值均与其原测定吸光值较为接近,均未达到显著水平。

3 讨论与结论

本研究结果显示,样品先经石油醚索氏回流前处理的,4种参试植物中有3种的提取液颜色比其未经过石油醚处理的颜色浅,且未经过石油醚处理的最终提取液较易出现沉淀物,说明石油醚索氏回流前处理有助于去除植物样中呈色类杂质及减少沉淀物出现。黄酮含量测定结果表明,除处理(5)中4種参试植物的黄酮含量测定结果均异常高以外,另外4种处理的组内差异均不显著,这说明在黄酮提取前是否采用石油醚前处理、或经过不同石油醚前处理对黄酮含量测定结果的影响都比较小,因此,在一般的黄酮含量测定中略去样品的石油醚前处理程序是可行的。经CK、石油醚超声30 min、石油醚浸泡15 h处理后,乌蕨、广金钱草样品的黄酮得率均比其未经石油醚处理的得率有所提高但差异均不显著,其相对提高率与香菜[2]、核桃叶[3]、银杏叶[8]黄酮的研究结果相近,但地胆头和鸡骨草的则有升也有降,因此,植物样品经石油醚前处理可提高黄酮得率的观点不具有普遍性,黄酮得率有可能因不同植物样品及不同前处理方法而不同。

多数植物材料提取之前经石油醚处理通常用量过大且耗时较长,而对初提物进行石油醚除脂处理则操作简单、用量少且耗时短[2]。纯的石油醚与乙醇可以任意比例互溶,但石油醚与70 %乙醇水溶液经混合静置后却可明确分层,且分层前后分层液面线并无明显变化,因此,可用70 %乙醇提取植物黄酮后再用石油醚萃取脱脂,如陈易彬等[13]采用了类似的处理方法。处理(5)的测定结果表明,未经过石油醚前处理的植物黄酮提取液,用石油醚对其进行萃取后,其黄酮含量测定值就远高于其原测定值;进一步的检验分析结果表明,以石油醚作为待测液按黄酮含量测定时,在未呈现任何红色特征反应的情况下其吸光值均高于地胆头、广金钱草、乌蕨样品黄酮测定的吸光值,这严重影响黄酮含量测定,70 %乙醇溶液用石油醚萃取后得到的下层乙醇溶液再按黄酮含量程序测得的吸光值也影响黄酮含量测定。由此说明,只要测定溶液中有石油醚,就算未呈现任何黄酮测定红色特征反应,都有可能测得干扰黄酮含量测定结果的假性吸光值。因此,石油醚对黄酮含量测定的影响不容忽视,分析其原因应该是经过萃取后下层提取液中尚有少量互溶或未完全分层离出的石油醚;进一步对前期脱脂相对较充分且含植物黄酮的CK处理提取液的分析结果表明,经石油醚萃取后,得到的各样品提取液的吸光值均高于其原吸光值,其中,地胆头、广金钱草均极显著高于其原吸光值,这表明经过石油醚萃取后黄酮含量的测定结果受到了显著影响;而经石油醚再萃取+热蒸干+再定容再处理后,各样品测得的吸光值均与其原吸光值较为接近,差异均未达到显著水平,这说明萃取后增加了“热蒸干+再定容”程序挥干余存的石油醚后其黄酮含量并未发生明显变化,该结果支持“石油醚除脂处理不会导致提取纯化过程中黄酮类物质的大量损失[2]”的观点。由此说明,石油醚前处理本身并不会造成黄酮得率的显著变化,只是经石油醚处理后待测液中余存的石油醚会干扰黄酮,含量测定造成结果偏高,但可采用热蒸干的方法除去其干扰,且该方法不会造成黄酮的显著损失。

综上,初步认为,石油醚前处理未必能提高植物样品黄酮得率,也不会造成黄酮的显著损失,在一般的植物黄酮含量测定中其并非必要程序,但若采用了该程序则应在黄酮含量测定前除去其中余存的石油醚以排除干扰。

参考文献

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