段亚豪，曹玉玺，吴祖芳，张文文，徐大伦，翁佩芳

(宁波大学食品与药学学院 动物蛋白精深加工技术省重点实验室，浙江 宁波 315211)

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜后经不同方式加工后的一种天然营养滋补品[1]。蜂蜜中总糖含量占蜂蜜干物质的95%以上，主要为葡萄糖和果糖，营养成分有180 多种，还含有大量的蛋白质、氨基酸、酶类[2]、矿物质、维生素以及芳香化合物等，具有较高的营养价值[3]。蜂蜜具备抗氧化[4]和抗菌活性，临床中用于抗衰老以及烧伤等，也作为中药炮制的辅料。依据国际食品法典委员会蜂蜜标准、欧盟蜂蜜指令及其他相关规定，蜂蜜种类按照来源、生产方式或外观划分[5,6]。最常见的是按照蜜蜂所采集植物种类来划分，主要蜜源是单一植物的称作单花种蜂蜜，杂花蜜或百花蜜来源于多种植物。我国是世界养蜂大国，蜂蜜品种种类和数量繁多，主要有乌桕蜜、油菜蜜、荆条蜜、向日葵蜜、荔枝蜜、龙眼蜜、柑橘蜜[7]、棉花蜜、枣花蜜、杂花蜜等。山乌桕(Sapiumdiscolor)又名野乌桕、红叶乌桕，属于大戟科[8]，在我国热带和亚热带地区广泛分布，是我国南方各地区的重要蜜源植物之一。山乌桕蜂蜜产量大，但因为有轻微的酸气味，润喉性差，结晶粒粗[9]等特点，销售情况不佳。用山乌桕蜂蜜作为原料酿造成酒，可以提高山乌桕蜂蜜产品附加值，增加养蜂者的收入，开拓蜂蜜加工新品种，促进养蜂业的发展。

目前蜂蜜应用于酿酒的开发方面已有一些文献报道，高玉荣[10]以蜂蜜为原料，酿造了低酒精度蜂蜜保健酒；潘亚芬[11]等对蜂蜜酒的现代化发酵工艺条件进行研究，探索性的将古代蜂蜜酒的酿造工艺与现代固定化细胞发酵技术相结合；赵江等[12]以蜂蜜为原料，使用红曲、酵母酿造蜂蜜红曲酒。在蜂蜜酒的酿造中大部分以单菌种发酵，在多菌种发酵方面报道很少；与单菌种发酵相比，混合菌种发酵表现出的特性更好，例如增加甘油含量和总酸度及产生多种挥发性酚类、酯类、酮类等特殊物质，改良果酒的质量和品质，使果酒的风味更加具有多样性[13-15]。以山乌桕蜂蜜为原料采用混合接种酵母菌方法开发山乌桕蜂蜜酒未见文献报道。

前期研究中已筛选获得了对发酵风味有重要贡献的东方伊萨酵母菌(Issatchenkiaorientalis166，简称Io)和酒精发酵的重要菌株酿酒酵母菌131(Saccharomycescerevisiae131，简称Sc)，以细胞混合培养相互影响因素和转录组测序研究作为基础[16]，进行复合菌种混合培养的细胞生长规律及混合菌发酵山乌桕蜂蜜酒的研究。电子鼻能对复杂风味和挥发性成分进行检测、分析和识别，检测结果不是样品中某种或几种成分的信息，而是挥发性物质整体信息即指纹数据[17]，可以对存在人为因素影响和识别精度低等缺点的感官评价进行弥补，具有客观、精确、方便、快捷，重复性好及无损等[18]优点。通过感官评定结合电子鼻技术分析山乌桕蜂蜜酒的香气特征，能够揭示混合菌发酵对山乌桕蜂蜜发酵酒风味形成的贡献。研究结果可丰富混合菌蜂蜜酒酿造技术理论，探明特色酒风味产生的微生物作用，同时对改善蜂蜜酒品质和提高蜂蜜酒酿造技术水平有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

山乌桕蜂蜜：浙江文成县阿标大叔蜜蜂养殖专业合作社提供，酒曲(文成县珍谷酒业有限公司提供)。

菌种：S.cerevisiae131(Sc)、I.orientalis166(Io)，均保藏于宁波大学食品生物技术实验室。

1.2 主要培养基和仪器

YPD培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L(固体加入20 g/L琼脂粉)，pH 5.5±0.2。

MM选择培养基：5 g/L蛋白胨、1 g/L酵母浸粉、15 g/L琼脂、5 g/L山梨醇，pH 5.5±0.2。

主要仪器：超净工作台，苏州净化设备有限公司；LDZX-40BⅠ型立式蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；XPX智能型生化培养箱，宁波江南仪器厂；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；PHS-3C pH计，上海精密科学仪器有限公司；电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；电子鼻检测仪，PEN3，德国AIRSENSE 公司，等。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

取两种甘油保藏的酵母菌种Sc和Io，分别划线于YPD固体培养基上，在30℃的恒温培养箱中培养，48 h后各取一环平板活化的酵母菌体于50 mL YPD液体培养基中，30℃，150 r/min摇床恒温培养24 h后于4℃的冰箱中保藏备用。

1.3.2 酵母菌发酵方法及生长的测定

活化好的两种酵母菌以1:1的比例接种于装有50 mL灭菌YPD液体培养基的锥形瓶中，并分别接种两种酵母菌作为纯培养对照，30℃，150 r/min恒温培养。混合培养及纯培养接种后培养液起始浓度均为2×105CFU/mL。

细胞数量测定采用平板计数法，由于酿酒酵母Sc和非酿酒酵母Io生长形态一致，肉眼难以区分，故采用MM选择培养基进行计数，Sc无法耐受山梨醇，Io可正常生长。

1.3.3 蜂蜜酒制备过程

用水将蜂蜜糖度稀释至24°Brix，柠檬酸调节pH至3.5，(NH4)2SO4添加量为0.1%，将调配好的蜂蜜稀释液倒入主发酵罐中，90℃灭菌15 min，待冷却至室温后接种。一组按5%接种量加曲，另一组接种10%混合菌种的种子培养液，分别按蜂蜜酒制备过程的操作程序经由主发酵，最后经过滤杀菌后陈酿，灌装为两种成品酒样。

图1 蜂蜜酒制备过程Fig. 1 Preparation process of honey wine

1.3.4 蜂蜜酒电子鼻分析

电子鼻检测条件：取2 mL样品于10 mL样品瓶中，并用保鲜膜密封，静置10 min后测量。采用顶空抽样的方法用电子鼻进行检测，检测时间500 s，传感器清洗时间200 s，电子鼻传感器及其性能见表1。用稳定状态下的信号进行分析，取400-402 s的信号作为电子鼻分析的时间点。每个样品重复5 次。

1.3.5 蜂蜜酒的感官分析

为了对山乌桕蜂蜜酒产品进行描述性分析，我们优选了10名训练有素的评估者(男性和女性，年龄为22-36岁)组成的小组参与了对蜂蜜酒的感官评定。培训他们认识和描述不同香气品质的能力，每个小组成员都有单独的部分。将室温控制至20-25℃，并在浅色光下进行分析，蜂蜜酒感官评定标准见表2。

1.3.6 数据分析

对采集挥发性气味信息进行多变量统计分析，包括主成分分析PCA、线性判别分析LDA[19]。主成分分析法是一种数据分析算法，具有典型性。主成分得分图是以散点图为基础，每个点代表一个样品的一次检验，点与点之间的距离代表不同检测次数之间特征差异的大小[20]。该实验数据处理由电子鼻系统自带软件完成，所有试验平行进行三次。

表2 蜂蜜酒感官评定标准

注：评定满分为100分，根据评定标准对酒样进行打分。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件下酵母菌的生长变化

考察两种酵母菌不同培养条件下纯培养及混合培养的生长规律。

2.1.1 有氧和厌氧条件下Sc与Io菌种纯培养的生长动态

分别在有氧和厌氧培养条件下(培养温度为30℃)，研究Sc与Io单菌株的生长动态，生长曲线如图2(A和B)所示。

图2 有氧和厌氧条件下各菌株纯培养的生长动态(A:有氧条件；B:厌氧条件)Fig. 2 Growth dynamics of pure culture of each strain under aerobic and anaerobic conditions (A: aerobic culture B: anaerobic culture)

2.1.2 Sc与Io菌混合培养的细胞生长行为

有氧和厌氧条件下Sc与Io菌株混合培养的生长动态，生长曲线以及Sc/Io细胞数量比率曲线如图3(A、B、C和D)所示。

有氧和厌氧培养条件Sc、Io混合培养最大细胞数的比较结果如图4所示。

在有氧条件纯培养时，Sc与Io均在30 h达到最大生长量，为2.2×108CFU/mL；在厌氧条件下纯培养时，Sc在30 h达到最大生长量，为3.5×107CFU/mL，Io在45 h达到最大生长量，为0.5×107CFU/mL。

在有氧混合培养45 h后，Sc和Io的最大生长量达到10.2×107CFU/mL和37.9×107CFU/mL(共48.1×107CFU/mL)，Sc/Io的比率呈下降趋势，非酿酒酵母Io能良好生长，生长量基本和纯培养一致，酿酒酵母Sc受到一定程度的抑制，原因可能是在混合培养时，由于相互竞争营养资源且相互抑制，未达到其纯培养时生长量。在厌氧混合培养条件下，在同一发酵周期内，Sc的最大生长量达到21×106CFU/mL，Io的最大生长量达到1.4×106CFU/mL(共22.4×106CFU/mL)，Sc/Io的比率先上升后下降。在有氧培养条件下最大生长量明显高于厌氧培养。

一些研究证明非酿酒酵母在发酵初期会产生一些有毒化合物类似糖蛋白、多肽、小分子量的信号分子等会抑制酿酒酵母的生长[21]。在后续实验中，非酿酒酵母生长量不断降低，逐渐被酒精耐受能力较高的酿酒酵母所取代，这可能是由于环境中酒精浓度升高，有机酸积累等导致的非酿酒酵母的衰亡[22]。

图3 有氧和厌氧条件下Sc、Io混合培养的生长动态及比率(A:有氧条件；B:有氧条件下Sc/Io细胞数量比率;C:厌氧条件;D:厌氧条件下Sc/Io细胞数量比率)Fig.3 Growth dynamics and ratio of Sc and Io by mixed culture under aerobic and anaerobic conditions (A: aerobic cultivation; B: ratio of Sc and Io under aerobic culture；C: anaerobic culture；D: ratio of Sc and Io under anaerobic culture)

图4 有氧和厌氧培养混合培养最大细胞数的比较Fig. 4 Comparison of maximum cell numbers in aerobic and anaerobic cultures

2.2 山乌桕蜂蜜酒感官评定

表3是由加曲发酵法与混合接种发酵法发酵所得山乌桕蜂蜜酒的感官评定得分表，加曲发酵法得分为66.4分，混合接种发酵法得分为78.2分。加曲发酵法酿制的蜂蜜酒因曲中色素进入酒液使得酒体颜色微红并呈琥珀色，外观澄清透彻；混合接种发酵法酿制的蜂蜜酒呈浅黄色，酒液有少许浑浊。结合图5，可以直观的看出两种发酵方法之间的差异，与加曲发酵法相比，混合接种发酵法酿制的蜂蜜酒口感较好，并保留了蜂蜜特有的蜜香。此外，加曲发酵法酿制的蜂蜜酒表现出较为强烈的苦味和涩味。

2.3 山乌桕蜂蜜酒风味成分分析

对加曲发酵、混合接种发酵山乌桕蜂蜜酒和未发酵山乌桕蜂蜜汁进行电子鼻检测，并利用电子鼻自带软件对数据进行分析，LDA和PCA分析结果分别如图6和图7所示。

从图6的LDA分析结果，两个判别式的总贡献率为100%，判别式LD1和判别式LD2的贡献率分别为99.97%和0.03%，能反映出三种样品的挥发性风味成分有明显区别。未发酵山乌桕蜂蜜汁的中心距远远小于其他两个样品，说明发酵蜂蜜酒样品较未发酵蜂蜜汁风味发生了较大变化。主要是因为发酵过程中酵母菌将蜂蜜汁中的还原糖代谢为醇、醛、酮、酸、酯等挥发性香气，造成风味成分变化。两个酒样风味成分对比有较大差异的原因是酒曲中的酵母菌与混合菌种中的酵母菌对蜂蜜中还原糖的代谢能力与产生的风味成分有差别，从而导致两种山乌桕蜂蜜酒风味组成上具有显著差异。

表3 山乌桕蜂蜜酒感官评定结果

图5 山乌桕蜂蜜酒感官评定结果Fig.5 Sensory evaluation of S. discolor honey wine

图6 不同加工方式下蜂蜜酒LDA分析Fig. 6 LDA analysis of honey wine under different processing methods

PCA是用于可视化构建数据矩阵的各种测量数据之间的相似性和差异性的方法。从图7的PCA分析，第一主成分和第二主成分的总体贡献率为99.94%，说明通过PCA分析信息可以反映不同发酵方式生产的山乌桕蜂蜜酒的香气具有差异。在PC1轴上，加曲法和混合菌种法位置得分高，表明蜂蜜汁在发酵过程中，风味成分已经发生了显著变化；沿着PC2轴，山乌桕蜂蜜汁和混合菌种发酵法的数值较为接近，而加曲发酵法数值处于负值，表明山乌桕蜂蜜汁和混合菌种发酵法样品可能有相似的风味成分，这与感官评定时混合菌种发酵法较好保留蜂蜜的蜜香吻合。根据加曲法和混合接种发酵法两种样品在PCA图中的分布，发现两种方法酿制的蜂蜜酒也存在明显差异，原因可能是：与混合菌种发酵方法相比，加曲法中的酵母菌产酒精能力强，其发酵进程快，导致产生风味成分的量与种类上存在差异。与其它分析仪器相比，电子鼻不能识别出现的化合物，它只是试图整合顶空挥发性化合物总量的测量值，并产生一个将显示样品之间的差异或相似性的香味模式。

图7 不同加工方式下蜂蜜酒PCA分析Fig.7 PCA analysis of honey wine under different processing conditions

3 结论

通过对酿酒酵母Sc和非酿酒酵母Io在有氧和无氧条件下纯培养及混合培养时的生长差异性比较，得出在有氧混合培养时，非酿酒酵母Io能良好生长，生长量基本和纯培养一致，酿酒酵母Sc受到一定程度的抑制；在无氧混合培养时，酿酒酵母Sc比非酿酒酵母Io生长情况要好。感官评定结果表明加曲发酵法得分为66.4分，混合接种发酵法得分为78.2分，即混合接种发酵法酿制的蜂蜜酒口感较加曲发酵法好，并保留了蜂蜜特有的蜜香，加曲发酵法酿制的蜂蜜酒表现出较为强烈的苦味和涩味。电子鼻分析表明，山乌桕蜂蜜发酵过程中挥发性风味物质发生了明显的变化，其判别式LD1和LD2的贡献率分别为99.97%和0.03%；通过PCA分析可反映不同发酵方式生产的山乌桕蜂蜜酒香气具有差异性，其第一主成分和第二主成分的总体贡献率为99.94%。山乌桕蜂蜜发酵酒的营养及保健功能有待进一步研究。