,*

(1.重庆第二师范学院生物与化学工程学院,重庆 400067;2.重庆第二师范学院,脂质资源与儿童日化品协同创新中心,重庆 400067;3.重庆江源油橄榄开发有限公司,重庆 401587;4.兰州海关综合技术中心,甘肃兰州 730000)

维生素E(Vitamin E,VE)是一种脂溶性维生素,是目前食品行业中最主要的抗氧化剂之一。VE不仅能有效抑制油脂氧化、防止油脂酸败变质,而且具有防癌、抗衰老等功效[1-3]。根据甲基的数目和位置的不同,天然维生素E分为α-VE、β-VE、γ-VE和δ-VE4种同分异构体,其中α-VE生理活性最强,β-和γ-VE次之,δ-VE几乎没有活性[4]。有研究表明,不同种类植物油中VE含量有较大差异,可作为植物油类别的指纹图谱用于植物油的鉴别和质量控制[1,5]。因此,如何快速、准确分析测定植物油中VE的种类及含量,对油脂掺伪、品质评价及质量控制至关重要。

表1 色谱柱信息及流动相Table 1 Mobile phase and information of columns

关于植物油中VE组分及其含量的研究报道较多,包括电化学法[6-7]、荧光光谱法[8-9]、气相色谱串联质谱法[10]、超临界流体色谱法[11-12]和高效液相色谱串联质谱法[13],由于反相液相色谱-荧光检测法具有较高的稳定性、灵敏度以及较低的检测成本,目前已成为VE分离分析的主流方法[14-16]。在众多相关研究中,未见对VE异构体在不同固定相上的保留特征参数进行系统性的研究,这在一定程度上限制了VE在不同固定相上色谱保留的特征,以及进一步对VE组分进行有效的分离检测。为了更准确的对VE异构体进行分离及定量,本文基于超高效液相色谱-荧光检测器,系统研究了不同固定相(BEH C18以及CSH FL色谱柱)对四种VE异构体的分离效果;通过对四种VE异构体的保留时间(Retention time,tR),分离度(Resolution,R)、拖尾因子(Tailing factor,Tf)以及容量因子(Capacity factor,k)作为指标对其保留特征进行讨论,而后对柱温、流动相及流速等色谱参数的优化,建立了一种高效、灵敏、准确测定不同的VE异构体测定方法,以期为VE的异构体在不同固定相上的保留特征以及植物油的鉴别和质量控制提供技术支持和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

初榨橄榄油(O1-O13)、调和油(T1-T2)、牡丹籽油(M1)、葵花籽油(K1)、大豆油(D1)、菜籽油(C1)、胡麻油(H1-H3)、芝麻油(Z1) 所有植物油样品均购自本地超市,样品避光冷藏保存;标准品α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE纯度>95%) 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇 均为色谱纯;其余试剂如无特殊说明均为分析纯。

Acquity UHPLC仪配荧光检测器 美国Waters公司;MS3涡旋仪 德国IKA公司;3K30冷冻离心机 美国Sigma公司;分析天平(±0.1 mg) 德国Sartorius公司;移液枪(100～1000、20～100 μL) 美国Thermo Electron公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 标准贮备液:分别精确称取α-VE、β-VE、γ-VE和δ-VE各5.00 mg,用乙腈溶液准确定容至100 mL容量瓶中,配制成50 mg/L的标准储备液,4 ℃冷藏待用。

标准工作液:分别准确转移0.2、2.0、10.0、20.0 mL标准贮备液至100 mL容量瓶中,乙腈准确定容,配制成0.1,1.0,10.0和20.0 mg/L的标准工作液;然后再分别准确转移0.1 mg/L的标准工作液10.0、5.0和2.0 mL至100 mL容量瓶中,配制成0.01,0.005和0.002 mg/L的标准工作液,4 ℃下冷藏待用。

1.2.2 样品处理 称取1.00 g样品于50 mL聚乙烯管中,加入20 mL乙醇溶液,涡旋2.0 min,放置-20 ℃冰箱冷冻15 min,然后置于2 ℃冷冻离心机中以10000 r/min离心5 min,取上清液1.5 mL,经0.22 μm有机相膜过滤后进样。整个处理过程避光进行。

1.2.3 UPLC色谱条件 色谱柱信息见表1;荧光检测器激发波长为300 nm,发射波长为330 nm;柱温30 ℃,进样量为1.0 μL;流动相A为乙腈或甲醇;流动相B为水,等度洗脱;使用Empower软件进行数据处理。

1.3 数据处理

2 结果与分析

为了深入研究维生素E异构体在不同固定相上的保留特征,本研究以四种VE异构体在不同固定相上的tR,R、Tf以及k的变化为指标,评价VE异构体的色谱保留特征。

2.1 BEH C18固定相下不同流动相及温度对异构体保留特征的影响

传统C18色谱柱由于键合技术及是否封尾从而直接影响色谱分离的稳定性、重现性、pH范围以及极性和/或碱性化合物的保留。亚乙基桥杂化(Ethylene Bridged Hybrid,BEH)颗粒技术是UPLC填料的主流技术,通过键合C18基团并经末端封尾,是UPLC分离中的通用型色谱柱。研究表明,BEH C18相较于传统C18而言,它们采用三键键合化学,不仅具有较低的键合相流失,且能在pH1～12的范围内使用,同时保证极性和/或碱性化合物较好的峰形及保留[17]。色谱分离条件见表1,当流动相分别为乙腈-水(9∶1,v/v)和甲醇-水(9∶1,v/v)时,四种VE异构体的分离见图1。

图1 BEH C18固定相下不同有机相分离四种维生素E异构体标准色谱图Fig.1 Separation of four vitamin E isomers by differentorganic phases under BEH C18 stationary phase注:A:甲醇-水;B:乙腈-水。

由图1可知,BEH C18固定相在VE异构体保留上和传统C18固定相相同,β和γ-维生素E不能分离,且柱温在35 ℃时,作为质子供体的甲醇和非质子供体的乙腈分别为流动相时,目标物保留时间改变分别为0.41、0.60和0.36 min,这说明目标物在保留过程中,流动相是否为质子供体,对目标物的保留影响不大。为了更好地研究BEH C18在不同温度及流动相下的保留特征,本试验以甲醇和乙腈分别作为流动相,柱温变化范围为30 ℃～50 ℃,以保留时间(tR)、分离度(Rs)、拖尾因子(Tf)及容量因子(k)为指标对VE异构体的保留特征进行研究,见表2。

由图1和表2可知,随着温度的升高,无论使用甲醇或者乙腈,β-VE和γ-VE均不能进行有效分离,目标物的Tf在1.14～1.46之间,基本满足色谱对称性的要求(0.9

2.2 CSH Fluoro-Phenyl固定相下不同温度及流动相对异构体保留特征的影响

表面带电杂化颗粒(Charged Surface Hybrid,CSH)技术下的氟苯基柱(CSH Fluoro-Phenyl)由于氟苯基的存在,带有低水平的表面电荷,提高样品负载量的同时保持了峰的对称性,在分离过程中具有偶极-偶极作用、芳香性(π-π)作用和疏水作用等多种保留机理,不仅对位置异构体、卤代化合物和极性化合物具有优异选择性,且可增强对酸性化合物的保留[19-20]。色谱分离条件见表1,当流动相分别为乙腈-水(7∶3,v/v)和甲醇-水(7∶3,v/v)时,四种VE异构体的分离见图2。

表2 不同温度及流动相时的tR,k,Rs,Tf和NTable 2 tR,k,Rs,Tf and N at different temperature and mobile phase

注:n.a:未响应;表3、表6同。

图2 CSH Fluoro-Phenyl固定相下不同有机相分离四种维生素E异构体标准色谱图Fig.2 Separation of four vitamin E isomers by different organic phases under CSH Fluoro-Phenyl stationary phase注:A:甲醇-水;B:乙腈-水。

为了更好的研究CSH Fluoro-Phenyl在不同温度及流动相下的保留特征,本试验同样以具有质子供体的甲醇和非质子供体的乙腈作为流动相,柱温变化范围为30～50 ℃,tR、Rs、Tf及k为指标对VE异构体的保留特征进行研究,见表3。

表3 不同温度及流动相时的tR,k,Rs,Tf和NTable 3 tR,k,Rs,Tf and N at different temperature and mobile phase

由图2和表3可知,CSH Fluoro-Phenyl为固定相时,当使用质子供体的甲醇和非质子供体的乙腈时,由于在分离过程中存在偶极-偶极作用、芳香性(π-π)作用和疏水作用等作用力,使得四种VE异构体的保留特征有着很大的区别。随着温度的升高,使用甲醇-水为流动相时,β和γ-VE能够达到部分分离,分离度在0.39～0.55之间,当温度达到50 ℃时,β-VE和γ-VE重合。此外,目标物的Tf在0.68～3.71之间,特别是温度为50 ℃,甲醇-水为流动相时γ-VE的Tf达3.71,这可能是由于固定相上存在多种保留机理,且较高的温度增加了目标物的二次吸附,导致拖尾[21,23]。再者,当使用甲醇-水为流动相时,目标物tR是乙腈-水为流动相时的3.7～6.2倍,且β-VE和γ-VE部分分离。k随着温度的升高,使用甲醇-水为流动相时,δ-VE、β-VE和α-VE的平均k值分别是乙腈-水为流动相时的5.65、6.16和6.57倍,这说明甲醇-水为流动相时,CSH Fluoro-Phenyl固定相对目标物具有较强的保留能力。由此可以看出,使用CSH Fluoro-Phenyl为固定相时,甲醇-水作为流动相,因为多种保留机理共同的作用,对四种VE的保留能力具有较大的影响[21]。

2.3 BEH C18及CSH Fluoro-Phenyl固定相的比较

通过2.1和2.2节分别对VE异构体在BEH C18及CSH Fluoro-Phenyl固定相上保留行为的研究可知,BEH C18在乙腈和/或甲醇作为流动相时,VE异构体的保留行为并未得到较大的改变,β-VE和γ-VE不能进行分离,这是因为键合的C18主要具有较强的非极性作用,且固定相、目标物以及流动相之间的作用力主要为疏水作用力[23]。而使用CSH Fluoro-Phenyl固定相作为色谱柱时,虽然乙腈-水作为流动相时,温度的改变对VE异构体的保留影响不大,但是甲醇-水作为流动相时,就VE异构体的tR而言,目标物的tR是乙腈作为流动相时的3.7～6.2倍,这主要是由于甲醇作为质子供体,与键合相氟苯基作用力增加,且由于氟苯基的存在,固定相、目标物以及流动相之间除了疏水作用外,还存在偶极-偶极作用、芳香性(π-π)作用等多种分子间作用力,对于异构体具有较强的分离能力,故β和γ-VE有了部分分离[22]。虽然CSH Fluoro-Phenyl固定相在甲醇-水作为流动相时对β-VE和γ-VE有一定的分离能力,但是较高的保留时间,严重的拖尾现象以及β-VE和γ-VE仅有的部分分离,影响VE的检测灵敏度及γ-VE定量的准确性[24]。鉴于此,本文仅将CSH Fluoro-Phenyl与传统BEH C18作为不同固定相对VE保留行为的影响进行对比,后续研究将以BEH C18作为固定相进行方法学考察及实际样品的检测研究。

表4 维生素E异构体的线性范围及检出限Table 4 Linear range and detection limit of vitamin E isomer

表5 回收率实验结果(n=6,%)Table 5 Results of recovery tests

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围和最低检出限 取标准储备液,稀释成5个浓度梯度,按优化后色谱条件进行测定,并绘制样品浓度(横坐标x,mg/L)与峰面积(纵坐标y,AU)标准曲线,进行线性回归分析,且当S/N为3和10时,该方法的最低检出限(LOD)及定量限(LOQ)如表4所示。结果表明,使用该方法对目标物的检测,在线性范围内具有良好的线性(r>0.9993),均能满足对植物油中VE异构体检测的要求。

2.4.2 样品加标回收率和精密度 在空白样品中添加高、中、低浓度的VE标准溶液,涡旋2.0 min后静置10 min,按1.2.2进行样品前处理,按1.2.3所述的色谱条件测定,以浓度值计算加标回收率。每一添加浓度样品重复测定6次来计算其精密度。结果见表5,结果显示,加标回收率在82.34%～105.17%之间,相对标准偏差(RSD)在1.7%～3.8%之间。

2.5 实际样品的测定

取所收集的23批次植物油样品,准确称取1.00 g,按1.2.2进行样品处理,按1.2.3所述的色谱条件进样分析,重复3次,计算VE的含量,若VE含量超出线性范围,则使用乙腈对样品进行相应的稀释处理,结果见表6;部分植物油样品色谱图见图3～图6。

图3 大豆油样品色谱图Fig.3 Chromatography of soybean oil sample

图4 橄榄油样品色谱图Fig.4 Chromatography of the olive sample

表6 植物油样品中维生素E的含量Table 6 Contents of vitamin E in oil samples

图5 菜籽油样品色谱图Fig.5 Chromatography of the colleseed oil

图6 牡丹籽油样品色谱图Fig.6 Chromatography of the Peony seed oil sample

由表6可以看出,所分析的23批植物油中,大豆油含有较高的δ-VE和β+γ-VE,含量分别达109.61和131.19 mg/L,调和油和菜籽油的VE含量相近,δ-VE、β+γ-VE和α-VE分别为6.01～6.32、69.26～69.99和38.50～43.31 mg/L之间;对于葵花籽油,牡丹籽油、芝麻油和胡麻油而言,葵花籽油具有较高的α-VE,但牡丹籽油和芝麻油中β+γ-VE却较高,胡麻油中β+γ-VE和α-VE含量高于δ-VE;作为果肉油的橄榄油,α-VE含量范围达103.39～304.54 mg/L,远高于β+γ-VE和δ-VE的含量,甚至部分橄榄油中未能检出δ-VE。由此可推断果肉油为代表的橄榄油与种子油中VE异构体含量有明显的差别。

3 结论

本研究利用RP-UPLC作为表征手段,以BEH C18和CSH Fluoro-Phenyl作为两种不同的固定相,通过Rs、Tf及k为指标对目标物保留特征进行评价,研究目标物在不同的色谱柱温度(30、35、40、45、50 ℃)及不同的有机相(甲醇和乙腈)下的保留特征。结果表明,甲醇为有机相,CSH Fluoro-Phenyl为固定相时,就VE异构体的tR而言,目标物的tR是乙腈作为流动相时的3.7～6.2倍,这主要是由于甲醇作为质子供体,以及固定相自身具有偶极-偶极作用、芳香性(π-π)作用等多种分子间作用力,对于异构体具有较强的分离能力,故β-VE和γ-VE有了部分分离。其余固定相及色谱条件均未有明显选择性差异。此外,利用BEH C18为固定相,乙腈为流动相对不同来源植物油进行了含量测定,方法学参数表明该方法可以满足植物油中VE的快速、准确、高通量的检测。通过不同植物油中的VE异构体含量的比较,果肉油为代表的橄榄油与种子油中VE异构体含量有明显差别,研究方法可为橄榄油等植物油掺伪鉴别提供依据及参考。