衣美艳,侯 虎2,毛 毛,郭 红

(1.山东东方海洋科技股份有限公司,国家海水鱼类加工技术研发中心分中心,山东烟台 264003;2.中国海洋大学,山东青岛 266003)

庸鲽(Hippoglossus)是鲽科庸鲽属最大的一种比目鱼,主要分布于拉布拉多及格陵兰至冰岛的北大西洋深海海域,其口感独特,风味良好且营养丰富[1]。目前庸鲽主要以加工成无骨鱼片的形式出口,其在加工生产过程中会产生鱼皮、鱼头与鱼骨等大量副产物,其中含有丰富的蛋白质、磷脂质、软骨素、维生素等[2],这些营养物质和有用成分是重要的生物资源,但目前这些下脚料主要用来生产鱼贮饲料、鱼粉等[3-5],对其中有价值的成分尚未充分利用。因此,如何深度开发鱼下脚料的利用途径,对水产品加工综合利用和保护环境有重要的意义。

庸鲽作为一种规模化生产的经济名贵鱼类,2004年被引入我国开始进行养殖技术积累和市场开发研究[6],目前我国鲆鲽类养殖产业已处于蓬勃发展时期[7],在此背景下,开展对庸鲽潜在价值开发及其应用的研究将具有很好的市场前景及现实意义。然而,目前对于庸鲽的相关研究较少,只有少数主要针对庸鲽繁殖的研究[6,8-9]和李文婧等人对大西洋庸鲽皮肤粘液中hipposin抗菌肽分离纯化的研究[10]。本文将针对庸鲽自身鲜美无鱼腥味、富含胶原的品质特性,利用其在加工过程中产生的约占鱼体重的 15%[11]的鱼骨副产物,通过响应面法进行酶解工艺研究,并对其酶解液氨基酸组成进行分析,探究其特性及开发应用前景,为庸鲽鱼骨的开发提供新思路,为其深入研究提供理论支持,同时提高庸鲽加工副产物附加值,促进海水鱼加工产业的技术升级及快速、健康发展,提高水产加工业的经济效益和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

庸鲽鱼骨 由烟台山海食品有限公司(烟台,山东省)提供;动物蛋白酶(90000 U/g) 合肥博美生物科技有限责任公司;甲醛 分析纯,迈瑞化学试剂有限公司。

日立L-8500氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司;HH4恒温水浴锅 金坛天瑞公司;A4103型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;K9860凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;FA1104N电子分析天平 上海菁海仪器有限公司;TDZ4低速大容量离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 庸鲽鱼骨→预处理→酶解→灭酶→离心→酶解液

1.2.2 工艺要点 将庸鲽鱼骨解冻,自来水清洗干净,斩碎呈1～2 cm左右小块,按照一定的液料比加入清水,然后加入一定百分比(总物料质量)的动物蛋白酶搅拌均匀,在一定温度条件下搅拌酶解一定时间后,灭酶处理10 min,待酶解液降到常温,以3000 r/min离心10 min,倒掉最下层沉淀,然后将中上层液体以5000 r/min离心15 min,滤除最上层油液,保留下层酶解液待用。

1.2.3 单因素试验 根据现实生产加工条件及前期预实验结果,以水解度为指标,利用动物蛋白酶对庸鲽鱼骨进行酶解工艺研究,分别考察液料比(质量比)、加酶量(总物料质量)、酶解时间和酶解温度对酶解效果的影响。

1.2.3.1 液料比对酶解效果的影响 在加酶量0.1%、酶解温度50 ℃、酶解时间1 h、pH=7条件下,分别设定液料比为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和1∶2,考察液料比对水解度的影响。

1.2.3.2 加酶量对酶解效果的影响 在液料比2∶1、酶解温度50 ℃、酶解时间1 h、pH=7条件下,加酶量分别设定为总物料的0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%,考察加酶量对水解度的影响。

1.2.3.3 酶解时间对酶解效果的影响 在液料比2∶1、加酶量0.15%、酶解温度50 ℃、pH=7条件下,酶解时间分别设定为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h,考察酶解时间对水解度的影响。

1.2.3.4 酶解温度对酶解效果的影响 在液料比2∶1、加酶量0.15%、酶解时间2 h、pH=7条件下,酶解温度分别设定为40、45、50、55 和60 ℃,考察酶解温度对水解度的影响。

1.2.4 庸鲽鱼骨酶解工艺条件优化 在单因素实验结果基础上,采用Box-Behnken设计方案,以液料比(质量比)(A)、加酶量(B)、酶解时间(C)为试验因素,并以1、0、-1分别代表变量的水平,以水解度作为响应值。采用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析。实验因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 酶解液水解度的测定 酶解液中总氮含量采用GB/T 5009.5-2010凯氏定氮法,酶解液中的氨基酸态氮含量采用甲醛电位滴定法测定,具体根据公式(1)计算其水解度(DH)[12]。

式(1)

1.2.6 游离氨基酸测定 待测酶解液样品不经酸碱水解,直接加水定容之后,经0.22 μm滤膜过滤后上样至日立L-8500氨基酸自动分析仪进行测定,取样量可视含量高低而定,待测液单种氨基酸浓度<1 μg/mL为宜[13]。

1.2.7 滋味贡献评价方法 采用呈味强度值(Taste Activity Value,TAV)法评价单个游离氨基酸对不同酶解液滋味的贡献,TAV指样品中各呈味物质的测定值与该物质味道阈值之比[14],计算公式如下:

式(2)

式中:C1为滋味化合物的质量浓度,g/100 g;C2为滋味阈值浓度,g/100 g。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析,以P<0.05为差异性显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对庸鲽酶解液水解度影响 由图1可以看出,随着液料比的降低即底物浓度的升高,水解度逐渐增大,在液料比为2∶1时,水解度最大,当底物浓度继续升高,水解度则呈下降趋势。这是因为随着底物浓度的增加,底物与酶分子接触点增多,酶解效率增加,水解度增大;但是当底物浓度过大时,底物的黏度影响酶与底物的充分接触,酶解效率下降,水解度降低[15-18]。因此,选取2∶1作为庸鲽鱼骨酶解最适液料比。

图1 液料比对水解度的影响Fig.1 Effect of different liquid ratios on hydrolysis degree

2.1.2 加酶量对庸鲽酶解液水解度影响 由图2可以看出,随着加酶量的不断增加,水解度呈先升高后缓慢降低的趋势。在加酶量为0.05%～0.15%时,随着加酶量增大,致使水解能力增强,水解度增加;但加酶量过高时,由于酶是蛋白质的属性,当达到一定浓度会发生相互水解现象,导致酶解效果下降,从而使水解度减小。因此,庸鲽鱼骨酶解最适加酶量为0.15%。

图2 加酶量对水解度影响Fig.2 Effect of different enzyme dosage on hydrolysis degree

2.1.3 酶解时间对庸鲽酶解液水解度影响 由图3可以看出,水解度随酶解时间的延长呈现上升趋势,在前1.5 h内,水解速率最快,在2 h后水解度的增加不明显,这是因为随着时间的延长,底物浓度逐渐降低,酶解活动基本趋于平稳甚至结束,所以综合考虑,选择2 h为最适酶解时间。

图3 酶解时间对水解度的影响Fig.3 Effect of different enzymetic time on hydrolysis degree

图4 酶解温度对水解度的影响Fig.4 Effect of different enzymetictemperature on hydrolysis degree

2.1.4 酶解温度对庸鲽酶解液水解度影响 由图4可以看出,随着温度的增大,水解度先增大后减小,在50 ℃时,达到最大值。这是因为随着温度的升高,酶的活性增加,反应速率增大,可使水解度升高,但温度再高会导致酶活性减弱甚至丧失,反应速率下降[19-20]。因此,选取50 ℃作为庸鲽鱼骨酶解的最适温度。

2.2 响应面试验

利用Design-Expert 8.0.6.1软件,根据单因素实验结果及Box-Behnken试验设计原理,以液料比、加酶量和酶解时间作为研究因素,采用三因素三水平响应面分析方法确定庸鲽鱼骨最佳酶解工艺条件,实验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Program and experimental results of Box-Behnken test

表3 回归模型方差及可信度分析Table 3 Analysis of variance and reliability of regression model

注:**差异极显著,P<0.01;*差异显著,P<0.05。 利用Design Expert软件对表2数据进行多元回归拟合,得到提取率对液料比(A)、加酶量(B)和酶解时间(C)的二次多项回归模型:

Y=33.02+0.43A+1.36B+1.06C+1.00AB-0.30AC-0.075BC-2.25A2-4.37B2-2.67C2

由图5可知,水解度随着液料比、加酶量和酶解时间的增大呈先增后减趋势,说明该模型具有极大值。响应面的陡峭程度随着加酶量、酶解时间的变化起伏较大,说明加酶量、酶解时间对水解度的影响大于液料比。以上分析与表3的方差分析结论一致。

图5 各因素交互作用对水解度影响的响应面图Fig.5 Response surface for the effects ofcordycepene on hydrolysis degree

通过上述数学模型对庸鲽鱼骨酶解工艺进行响应面优化分析,得到最佳工艺条件为液料比2.12∶1,加酶量0.16%,酶解时间2.10 h,此条件下庸鲽鱼骨酶解液水解度为33.26%。考虑到实际操作情况,将酶解工艺参数修正为液料比2∶1,加酶量为0.16%,酶解时间2 h。为检测模型的可靠性,对优化条件进行验证试验,得到庸鲽酶解液水解度平均值为32.79%±0.33%,与预测值相近,偏差较小,说明通过响应面优化得到的庸鲽鱼骨酶解条件有效。

2.3 庸鲽鱼骨酶解液中氨基酸组成分析

由表4可知,庸鲽鱼骨酶解液中含有人体8种必需氨基酸且相对含量占33.3%,高于栾君笑等人测出的鲽鱼骨蛋白胨中必需氨基酸含量28.17%[24],这可能与鲽鱼种类、不同生长时期或者酶解条件不同等因素有关。因为牛奶中乳蛋白的必需氨基酸含量与FAO/WHO提出的理想蛋白质的必需氨基酸含量(1991)非常接近,被认为牛奶是营养价值最高的食品之一[25],由表5可以看出,庸鲽鱼骨酶解液中异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸与FAO/WHO提出的理想含量基本接近,又因异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苏氨酸与牛奶乳蛋白中含量基本接近,因此可以认为,庸鲽鱼骨酶解液的氨基酸组成合理,能够满足人体对必需氨基酸的营养需求,可利用价值较高。

表4 庸鲽鱼骨酶解液氨基酸组成Table 4 Amino acid composition in enzymatic solution

注:a甜味氨基酸;b苦味氨基酸;c鲜味氨基酸;d药效氨基酸;-呈味不明;*必需氨基酸。

表6 庸鲽酶解液主要游离氨基酸分别与南极磷虾酶解液及三种贝类[13]游离氨基酸TAV比较Table 6 Comparison of the the taste activity values of free amino acids in enzymatic solution of hippoglossus boneand krill protein enzyme-hydrolysates and three common shellfish[13]

表5 庸鲽鱼骨酶解液与乳蛋白中必需氨基酸含量和FAO/WHO推荐量比较Table 5 Comparison of the content of essential amino acidsin enzymatic solution and lactoproteinand recommended amount of FAO/WHO

另外,由表4可知,庸鲽酶解液中药效氨基酸含量为34.2%,高于海参内脏酶解粉中药效氨基酸含量10.27%[22],其中含量最高的谷氨酸是人体中枢神经系统内的重要神经递质,通过与其受体作用,调节正常脑内几乎所有的功能,包括学习功能和记忆功能[26]。甘氨酸则对大鼠TBI具有神经保护作用,对TBI后相关炎症因子过度增高的抑制可能部分解释其神经保护作用机制[27]。而精氨酸对人体营养代谢与调控也有重要作用,如精氨酸是维持婴儿生长发育不可缺少的氨基酸,对治疗肝昏迷起到重要促进作用[28]。因此,庸鲽酶解液可作为功能性食品基料用于特殊医学用途食品、保健药及保健食品中。

庸鲽鱼骨酶解液除了具有较高的营养价值外,还具有丰富的呈味氨基酸。根据氨基酸的呈味特性,分为鲜味、甜味、苦味三种[29],甜味氨基酸和鲜味氨基酸作为良好呈味基料的基础,可呈现出良好滋味[30-31]。由表4可知,庸鲽鱼骨酶解液中鲜味氨基酸含量为52.6%,甜味氨基酸含量为41.4%,分别高于南极磷虾酶解液中鲜味氨基酸含量13.27%,甜味氨基酸含量30.24%,而庸鲽酶解液中苦味氨基酸为38.2%,则低于南极磷虾酶解液中苦味氨基酸含量45.50%[14],说明庸鲽酶解液具有较好的风味特性。

目前,采用呈味强度值(TAV)法评价单个游离氨基酸对不同酶解液滋味的贡献大小,通常认为,当TAV大于1时,该物质对样品呈味有重要影响,并且数值越大,贡献越大。由表6可以看出,谷氨酸的TAV(17.33)对庸鲽酶解液鲜味贡献最大,并且远高于另外四种酶解液中TAV值,说明庸鲽酶解液鲜味显著。通过TAV比较可知,丙氨酸对庸鲽酶解液甜味贡献较大,另外,其与谷氨酸等鲜味物质相互作用还具有提鲜效果[32],甘氨酸的TAV虽相对较小,但其本身具有的爽快甜味,不仅能减少苦味,还能从食物中去除不良的口味[33]。庸鲽酶解液中的苦味主要由赖氨酸和精氨酸呈现,但精氨酸并不是苦味的贡献者,其有增加呈味复杂性和提高鲜度的作用[34]。综上,庸鲽鱼骨中含量丰富的呈味氨基酸互相作用,使其呈现出强烈的鲜味,品之味道鲜美。由此可得,庸鲽鱼骨酶解液不仅具有很高的营养价值,而且风味良好,既可以作为优质蛋白来源或特医食品与其它功能食品呈味改良剂,也可以作为呈鲜调味料的研发基料。

3 结论

本研究通过对庸鲽鱼骨酶解工艺条件研究,确定最佳酶解条件为液料比2∶1,加酶量为0.16%,酶解时间2 h,庸鲽鱼骨酶解液水解度达到32.79%±0.33%;对其氨基酸组成进行分析研究,发现庸鲽鱼骨酶解液中含有人体所需的8种必需氨基酸且相对含量占33.3%,其中必需氨基酸的含量与牛奶中乳蛋白必需氨基酸含量及FAO/WHO提出的理想蛋白质的必需氨基酸含量(1991)基本接近,说明庸鲽鱼骨的营养价值较高,另外,药效氨基酸含量为34.2%,甜味氨基酸含量为41.4%,苦味氨基酸为38.2%,鲜味氨基酸含量为52.6%,其中含量最高的谷氨酸不仅具有很强的生物活性功能,而且其与天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等鲜味氨基酸一起作用,使庸鲽鱼骨酶解液呈现出强烈的鲜味。表明庸鲽鱼骨酶解液不仅具有很高的营养价值,而且风味良好,既可以作为优质蛋白的来源或特医食品与其它功能食品呈味改良剂,也可以作为呈鲜调味料的研发基料,具有很高的应用和开发价值。