胡凌波 周仁杰

(浙江省台州医院肝胆胰外科，浙江 台州 317000)

原发性肝癌和病毒性肝炎、肝硬化关系密切，是肝细胞发生的恶性肿瘤；原发性肝癌的病因和发病机制尚不十分明确〔1〕。原发性感染的发病率和死亡率比较高，对人类健康造成严重危害。原发性肝癌早期症状不明显，不少患者被确诊时已为原发性肝癌中晚期，错过了治疗的最佳时间，即使可以得到根治性的治疗，5年内复发率仍比较高〔2〕。原发性肝癌病情发展可导致肝衰竭，晚期癌细胞增殖，向周围组织及远处器官扩散，恶化程度增加〔3〕。因此早诊断早治疗可有效提高原发性肝癌的预后。miRNAs为非编码小分子RNA，具有调控基因表达，可干扰转录和翻译，从而对靶基因的表达进行调节，在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔4,5〕。本文对原发性肝癌血清miR-6861-5p水平进行研究，探讨其与原发性肝癌临床病理特点的关系及其在诊断和预后预测中的价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择浙江省台州医院2010年1月至2013年12月原发性肝癌患者80例作为原发性肝癌组和健康体检者80例作为对照组。原发性肝癌组年龄(61.24±12.41)岁，男52例，女28例；肿瘤直径≥5 cm者43例，<5 cm者37例；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期19例，Ⅲ22例，Ⅳ期14例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移55例；远处转移11例，无远处转移69例。对照组年龄(60.89±11.53)岁，男47例，女33例。原发性肝癌组和对照组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：原发性肝癌患者均为首诊、进行手术治疗的患者，且经病理证实为原发性肝癌，手术前未进行放化疗及其他相关治疗，所有研究对象签署知情同意书。排除标准：重要脏器功能不全者，合并其他恶性肿瘤者，围术期死亡者，临床资料及随访资料不全者，术后无法接受随访及中途退出者。

1.2研究方法 血清miR-6861-5p水平测定：抽取原发性肝癌组和对照组患者外周血5 ml，采用miRNA提取试剂盒(购自HaiGene公司)提取总miRNA，对提取的miRNA进行反转录(反转录试剂盒购自HaiGene公司)，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定血清miR-6861-5p水平(仪器及试剂盒购自购自HaiGene公司)，PCR条件为95℃ 10 min，95℃ 30 s，55℃ 20 s，共42个循环，然后60℃ 1 min。以U6为内参照。miR-6861-5p上游引物为：5'-ACAC TCCA GCTG GGAC TGGG TAGG TGGG C-3'，下游引物为：5'-GTGC AGGG TCCG AGGT-3'。血清miR-6861-5p水平以2-ΔΔCT表示。

1.3随访 原发性肝癌患者术后采用电话或门诊随访，随访时间从患者手术时间开始至随访截止时间或术后死亡时间，随访截止时间为2017年12月31日。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验，血清miR-6861-5p水平对原发性肝癌的诊断价值采用受试者工作特征(ROC)曲线下面积分析，生存曲线采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析。

2 结 果

2.1原发性肝癌组和对照组血清miR-6861-5p水平比较 原发性肝癌组血清miR-6861-5p水平明显高于对照组(1.87±0.21 vs 1.00±0.06，t=35.629,P=0.000)。

2.2血清miR-6861-5p水平与原发性肝癌临床病理特点的关系 血清miR-6861-5p水平与原发性肝癌的TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、有远处转移者血清miR-6861-5p水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移和远处转移者；血清miR-6861-5p水平与年龄、性别、肿瘤直径无关(P>0.05)，见表1。

表1 血清miR-6861-5p水平与原发性肝癌临床病理特点的关系

2.3血清miR-6861-5p水平对原发性肝癌的诊断价值 ROC曲线显示：血清miR-6861-5p以1.35为诊断阈值，诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积为0.863(95%CI：0.860～0.866)，诊断敏感度为75%，诊断特异度为87%。见图1。

2.4血清miR-6861-5p与原发性肝癌生存期的关系 以ROC曲线中血清miR-6861-5p的中位数值为界，高表达患者的无病生存期为(23.41±14.57)个月，总生存期为(34.82±10.48)个月；低表达患者的无病生存期为(32.15±15.36)个月，总生存期为(42.57±11.06)个月。miR-6861-5p低表达患者的无病生存期和总生存期均明显高于高表达患者(P=0.011、0.015)。见图2和图3。

图1 血清miR-6861-5p诊断原发性肝癌的ROC曲线

图2 血清miR-6861-5p与原发性肝癌无病生存期的关系

图3 血清miR-6861-5p与原发性肝癌总生存期的关系

3 讨 论

原发性肝癌是恶性肿瘤相关性死亡的原因之一，随着医学水平的发展，原发性肝癌的早期诊断取得了一定进步，但由于原发性肝癌肝内转移和侵袭的存在，预后仍比较差，且原发性肝癌的复发率高、容易转移，使原发性肝癌的总生存期不是太理想〔6,7〕。因此寻找原发性肝癌的生物标志物在原发性肝癌的诊断、治疗及预后预测中具有重要价值。

miRNA长度为20～25个核苷酸，为一类内源性的非编码单链RNA，在真核细胞生物中广泛存在〔8〕。人类miRNA在人类基因组中的比例比较小，约占1%，其中大约50%定位于染色体脆弱区，染色体脆弱区和人类癌症的发生发展关系密切〔9〕。miRNA在细胞核中经过RNA聚合酶催化可转录成初级miRNA，初级miRNA长度约数千核苷酸，随后被RNA酶识别并切割成前体miRNA，前体miRNA具有发夹结构，在核转运蛋白5的作用下，转运至细胞质内，被另一种RNA酶剪切成miRNA-miRNA二聚体，该二聚体结合Argonaute蛋白，激活反应RNA结合蛋白，然后被切割成两条miRNA单链，其中一条单链游离出复合体，很快被降解，而另一条单链为成熟的miRNA，在RNA介导的沉默复合体形成中发挥重要作用；当miRNA完全绑定目标信使RNA时刻造成mRNA降解；当miRNA不完全绑定时可阻遏其转录，发挥基因沉默作用〔10〕。不同的miRNA对细胞的调控作用不同，在原发性肝癌中存在多种miRNA异常，参与原发性肝癌的发生发展过程〔11,12〕。

miRNA在外周血中有丰富的稳定表达，由于miRNA内源性结构特性决定了血清miRNA具有抗核糖核酸酶的能力，血清中miRNA即使经过pH值改变、反复冻融等仍可以维持稳定〔13〕。血清miRNA的稳定性使其被认为是最具潜力的恶性肿瘤生物标志物〔14〕。在原发性肝癌患者血清中存在多种miRNA水平异常，多种血清miRNA被证实在原发性肝癌的诊断、治疗及预后预测中具有重要价值，为原发性肝癌的潜在肿瘤标志物〔15,16〕。

miR-6861-5p定位在人染色体12q24.13上，关于miR-6861-5p功能的研究不多，袁超〔17〕研究发现乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平升高，是乳腺癌术前诊断、临床分期、细胞转移和术后检测复发的潜在生物标记物；Shimomura等〔18〕研究发现乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平高于健康女性，且血清miR-6861-5p与血清miR-1307-3p、miR-1246、miR-4634、miR-6875-5p联合诊断乳腺癌的灵敏度为97.3%，特异度为82.9%；付红伟等〔19〕研究发现乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平升高，miR-6861-5p联合CA153对乳腺癌具有比较高的诊断效能，可作为乳腺癌诊断的一种有效手段。本研究结果表明随着原发性肝癌病情严重程度加重，血清miR-6861-5p水平升高，血清miR-6861-5p水平在判断原发性肝癌病情严重程度和预后预测中也具有重要价值。