徐欢 习小庆 钟德平 郑增斌

(1上饶市人民医院泌尿外科，江西 上饶 334000；2南昌大学第二附属医院泌尿外科)

前列腺癌是一种男性生殖系统恶性肿瘤，在我国因男性人口平均年龄的增长、泌尿系结石、前列腺增生等相关疾病发生率上升，烟草泛滥，生活中致癌危险因素的增多，前列腺癌的发生率快速上升〔1〕。前列腺癌诊断方法包括体格检查、影像学检查、标志物检测，近年来基因检测在恶性肿瘤诊断中的价值越来越受到重视，相较于其他诊断方法，可以实现量化分析，特异性更强〔2〕。有报道显示，TMPRSS2-ERG基因融合在前列腺癌发生中扮演了重要角色，可能是癌变的先发事件〔3〕。本研究评价TMPRSS2-ERG融合基因检测在前列腺癌诊断中的临床价值。

1 材料与方法

1.1实验材料 2010年10月至2018年10月上饶市人民医院泌尿外科诊治的15例前列腺癌手术患者为肿瘤组，年龄54～85岁，平均(67.8±2.5)岁。良性前列腺增生患者15例为增生组，年龄54～83岁，平均(67.4±2.3)岁。两组年龄差异无统计学意义(χ2=6.24，P>0.05)。纳入标准：①最终经过病理检查确诊，肿瘤样本参照Gleason指数分类细胞肿瘤分期系统(TNM)分类诊断；②组织保存完好；③在手术前，未进行放化疗；④年龄≥60岁。排除标准：①组织样本质量差，无法进行基因检测；②术前辅助放化疗。

1.2仪器与试剂 普通冰箱，丹麦 Termobrite S500 原位杂交仪，爱特尔HSX-250恒温水浴锅，日本 XW-80A旋涡混合器，日本 OLYMPUS BX51荧光显微镜，湖南湘仪MINI-10K迷你离心机，北京SQX-4-CP FISH分析软件，湖北泰维 R138型切片机，TEC2602烤片机，移液器。试剂包括二甲苯、甲醇、IGH双色基因探针、ATM单色基因探针、乙醇溶液、去离子水、SSC缓冲液、变性液(70%甲酰胺/2×SSC，pH7.0～8.0)、洗涤液等。

1.3标本处理 采用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，常规石蜡包埋，连续切片厚度3 μm，二甲苯和梯度酒精水化，进行苏木素-伊红(HE)染色、FISH检测。标本都采用甲醛溶液保存，在医院按照常规的病理检查、HE染色、免疫组化分析，常规方法无法诊断的对象，进行FISH检测。本文选择符合纳入、排除标准的样本。对于选择的样本，将病理切片采用二甲苯脱水、脱蜡2次，每次10 min，而后浸入到100%乙醇，5 min，而后梯度乙醇脱水。将组织切片浸入到去离子水，3 min，拭去多余的水分。90℃去离子水处理切片，30 min。将切片浸入到蛋白酶K消化液，37℃孵化，30 min，再使用2×SSC缓冲液，前后2次，每次10 min。常温下，1%甲醛溶液处理，10 min，采用梯度乙醇脱水，自然干燥，加热至56℃。

1.4融合基因检测 采用荧光原文杂交检测法检测，在暗处将10 μl探针混合物(探针2 μl+杂交缓冲液8 μl)加至相应的玻片杂交区域，覆盖盖玻片并封片,杂交仪变性杂交过夜；杂交条件42℃16 h以上。杂交后用2×SSC和0.01%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)/2×SSC洗涤液漂洗10 min，置70%乙醇中漂洗3 min；暗处自然干燥。将10 μl的4,6-联脒-2-基吲哚二盐酸盐复染剂滴加在标记的杂交区域位置，并盖上盖玻片，暗处放置20 min后在荧光显微镜下观察。使用荧光显微镜观察样本，评价图像的质量，选择其中成像理想的区域，采用DP11显微照相机对区域拍摄，VT FISH软件处理数据，保存图片、数据。VT FISH软件通过分析荧光信号的不同颜色，分析细胞的基因表达信号强度，判断是否为正常细胞或异常细胞，计算不同细胞的比重。选择TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1，TMPRSS2-ETV4三种探针，每组探针检测100个细胞，计算检测阈值，阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)。

1.5观察指标 两组FISH检测结果，融合基因诊断前列腺癌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率。对比前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因阳性对象、阴性对象的血清PSA水平、前列腺Gleason评分水平。

1.6统计学处理 采用SPSS16.0软件处理，计算TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4三组融合基因的阈值，对比两组融合基因检测结果，数据比较进行χ2检验或确切概率法，血清PSA水平、前列腺Gleason评分水平非正态分布，采用中位数与四分位距M(P25，P75)表示，非参数检验，P<0.05时表示具有统计学意义。

2 结 果

2.1基因融合检测结果 两组TMPRSS2-ERG融合基因阳性及阴性分布、TMPRSS2-ETS融合基因阳性及阴性分布差异有统计学意义(P<0.05)。两组TMPRSS2-ETV1融合、TMPRSS2-ETV4融合基因阳性及阴性分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2诊断效用 TMPRSS2-ERG融合基因诊断前列腺的灵敏度、符合率显著低于TMPRSS2-ETS融合基因(P<0.05)。见表2。

2.3前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因临床特征 前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因阳性对象的PSA显著高于阴性对象，差异有统计学意义(P<0.05)，阳性及阴性对象的Gleason评分差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 两组TMPRSS2四种融合基因检测结果(n,n=15)

表2 TMPRSS2-ERG融合基因、TMPRSS2-ETS融合基因诊断前列腺癌效用对比(%)

与TMPRSS2-ERG相比:1)P<0.05

表3 前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因阳性及阴性对象PSA、Gleason评分对比〔M(P25，P75)〕

与阴性相比:1)P<0.05

3 讨 论

ERG基因主要包括调控生长因子及其受体、参与信号传导及细胞周期相关基因调控，调节造血系统发育与分化，ERG基因与白血病、恶性肿瘤发生关系密切〔3〕。TMPRSS2基因结构集中在前列腺基底细胞、前列腺癌细胞中。因此TMPRSS2-ERG融合基因与前列腺基底细胞恶性病变关系密切。TMPRSS2-ERG是前列腺癌常见的基因融合类型，T-E融合基因通过与雄激素受体、依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)、核因子κB、含半胱氨酸分泌蛋白3的相互作用，诱发前列腺癌〔4〕。

本研究显示，TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETS融合基因在良性前列腺疾病、前列腺癌中的分布存在显著差异。本文采用的病理样本检测基因，理论上更能反映融合基因与前列腺病变之间的关系，良性恶性对象融合基因差异应相较于尿液、血液检测更为显著。有报道显示两种疾病的TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4融合基因异常率也存在显著的差异，这可能与本研究中纳入对象例数较少、研究方法差异有关〔5〕。有报道显示，检测血清中TMPRSS2相关融合基因也可以辅助诊断前列腺癌，但是不同检测方法显然会影响检测的结果。 不同文献报道的前列腺癌TMPRSS2-ERG表达存在较大的差异，发生率为40%～80%〔6〕。本研究中前列腺癌对象为53.3%，处于正常水平，T-E融合基因在少数病例中会产生融合蛋白，同时产生序列时间短，不参与生物学活动，可以忽略。反映了TMPRSS2-ERG融合基因可能与临床特征有关，不同研究中的前列腺癌发生机制、流行病学存在差异，从而导致T-E融合基因异常率存在差异。本研究还发现，前列腺癌、良性前列腺增生对象TMPRSS2-ETS融合基因阳性及阴性分布差异有统计学意义，且这种差异较TMPRSS2-ERG融合更为显著，但是有关于该基因融合的研究非常少，今后需要进一步分析该融合在前列腺癌发生中的起作用机制。

本研究TMPRSS2-ERG阳性对象的PSA高于阴性对象，与其他文献〔7〕报道的结果并不一致，这可能与纳入样本PSA检测的质控水平有关，PSA容易受到前列腺炎症活动影响。本研究未得出阳性及阴性对象的Gleason评分差异显著的结论，相关文献〔8〕报道TMPRSS2-ERG融合基因与Gleason评分的关系结论存在较大的差异，这与流行病学特征存在差异有关，反映了TMPRSS2-ERG融合基因与前列腺癌复杂关系。TMPRSS2-ERG融合基因异常可能是前列腺癌的始动因素，即在恶性突变中可能发挥了关键的作用，但是在肿瘤的发生、进展过程中的作用可能并不强。有文献〔9〕报道显示，TMPRSS2-ERG融合基因异常并不是前列腺癌发生的必要条件，即其灵敏度相对较低，特异性相对较高，可以达到100%，可以降低假阳性率。有关于前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因阳性的影响因素研究较少，从国内外研究来看，存在显著人种差异，若能结合因素分析，可以更好地提升TMPRSS2-ERG融合基因诊断前列腺癌价值。

本研究仅对病理组织中的融合基因进行检测，而想要获得病理组织，便必须进行手术或活检，TMPRSS2-ERG融合基因检测可能无法作为活检的依据，而是作为活检病理检查的辅助指标，这削弱了TMPRSS2-ERG融合基因检测的价值。目前许多基因检测都陷入了这样的困境，即许多结果都是基于病理组织而得出的，无法作为活检适应证依据。而目前前列腺癌筛查诊断中活检存在过度的风险，对于PSA阳性的对象活检率居高不下，因此需控制不必要的活检。从这一角度来看，今后需要开展血液、尿液TMPRSS2-ERG融合基因检测研究，以发挥TMPRSS2-ERG融合基因检测强特异性的优势，与血清PSA检测一起指导活检，排除PSA假阳性的风险，避免不必要的活检。近年来，有学者尝试采用聚合酶链式反应检测尿液中的T-E融合基因，减少了活检，直接消除了患者活检产生的紧张情绪，这种非侵入性检测更易被接受〔10〕。

TMPRSS2-ERG融合基因检测在前列腺癌诊断中有一点的价值，尽管诊断效用不如TMPRSS2-ETS融合基因，但是可以进一步评估血清PSA检测结果，配合其他检查评估疾病恶性风险。今后需要探索尿液TMPRSS2-ERG融合基因检测方法，以作为筛查技术，指导活检，同时还可以作为疑难病例诊断的证据，避免误诊。