李赛莲 许保 陈正义 黄晓曦 陈建强

(中南大学湘雅医学院附属海口医院消化内科，海南 海口 570208)

结直肠癌为临床常见的一种消化道恶性肿瘤，最近研究显示，结直肠癌的临床发病率及病死率呈上升趋势，但目前临床对其发生及发展机制尚未完全明确〔1〕。由于结直肠癌早期症状较为隐匿，多数患者就诊时已为进展期，或失去手术治疗机会，而放化疗治疗效果不明显。目前，肿瘤标志物糖类抗原(CA)199及癌胚抗原(CEA)已被应用于结直肠癌的临床诊断，李少兰研究发现CEA、CA199诊断结直肠癌的灵敏度分别为61.67%、34.67%〔2〕。蔡尚党等〔3〕学者研究报道，CEA、CA199诊断结直肠癌的灵敏度分别为60.87%、36.96%，由此可见，CEA、CA199诊断结直肠癌的灵敏度欠佳。miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA，广泛参与细胞增殖、分化、代谢等生物学过程，其异常表达与恶性肿瘤密切相关〔4〕。近年有学者报道，miR-335在胃癌〔5〕、宫颈癌〔6〕、非小细胞肺癌〔7〕等多种恶性肿瘤中发挥重要作用，但临床对miR-335与结直肠癌的研究报道较少。本研究旨在分析结直肠癌患者血清及组织中miR-335的表达变化特点，明确miR-335在结直肠癌临床诊疗中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2017年12月中南大学湘雅医学院附属海口医院消化内科收治的98例结直肠癌患者，排除肛管癌、结直肠多发性息肉及家族性腺瘤性息肉病等其他恶性肿瘤者。男53例，女45例；年龄39～74〔平均(54.80±4.72)〕岁；肿瘤直径1.7～9.2 cm；肿瘤类型：直肠癌65例，结肠癌33例；分化程度：高分化21例，中分化49例，低分化28例；临床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期39例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例；31例有淋巴结转移，67例无淋巴结转移。另选取同期来院体检健康的90例居民作为对照组，男47例，女43例；年龄37～66〔平均(53.05±3.19)〕岁。两组性别及年龄比较无显著差异(P>0.05)。本研究经中南大学湘雅医学院附属海口医院医学伦理委员会审批。

1.2样本收集 分别采集两组清晨空腹静脉血5～8 ml，结直肠癌患者于治疗前采集，健康对照组于体检当日采集，将采集的样本于48 h内经离心(1 000 r/min，10 min)处理后取上清液，置于-80℃冰箱中保存待检。于术后15 min内收集结直肠癌组织及癌旁正常组织样本(距癌组织边缘≥2 cm)，保存于-80℃冰箱中待检。

1.3miR-335检测 取待测样本，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，DEPC水溶解，然后取1 μl RNA检测其完整性。应用光度计分别检测血清及组织样本中RNA的纯度及浓度。用逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，反应体系为20 μl：总RNA 1.0 μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl、10×RT缓冲液 1.5 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、20 U/μl RNA酶抑制剂0.19 μl、1 μmol/L逆转录特异性引物3 μl，加DEPC水补至20 μl。反应条件：16℃ 15 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min，反应产物置于4℃保存。miRNA-335逆转录引物序列为：5'-GUUGAGUUCUCUAGAUCAGACCUGGCGAUAAGGACCCGUGAGGCACUCUACCA-3'；U6逆转录引物序列为：5'-CGCTTCATTCGACGTATGGCATT-3'。以cDNA为模板行PCR检测，反应体系为25 μl：2×All-in-OneTM Q-PCR Mix 10 μl、50×ROX Reference Dye 0.4 μl、上游引物2 μl、下游引物2 μl、cDNA模板 2 μl，加Nuclease-Free Water补至20 μl。反应条件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，40个循环，72℃ 5 min。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-335的相对表达量。miRNA-335上游引物：5'-AUGAGUGCGCGCUCGAUUAAGCC-CUAUUGUCAUCAUGGAACAUG-3'，下游引物：5'-AGCUCGCACUCAGAAUACAGUCU-3'；U6上游引物：5'-CTCTCCGGTGCAACGCA-3'，下游引物：5'-AGCACTCACGTATTATGTCG-3'。

1.4统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验、单因素方差分析，受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-335在结直肠癌诊断中的价值。

2 结 果

2.1血清和组织样本中miR-335表达水平 结直肠癌组患者血清中miR-335的相对表达量为(0.63±0.18)，癌旁正常组织组血清中miR-335的相对表达量为(0.94±0.25)，健康对照组血清中miR-335的相对表达量为(1.09±0.34)，3组比较差异有统计学意义(F=5.103，P=0.000)；与癌旁正常组织比较，结直肠癌组织中miR-335的相对表达量明显下降(t=7.415，P=0.000)；与健康对照组比较，结直肠癌组患者血清中miR-335的相对表达量明显下降(t=9.276，P=0.000)。

2.2结直肠癌患者血清和癌组织中miR-335的表达与临床病理特征的关系 不同临床分期、分化程度及是否发生淋巴结转移的结直肠癌患者血清和癌组织中miR-335的相对表达量比较差异显著(P<0.05)；不同性别、年龄、肿瘤直径及肿瘤类型的结直肠癌患者血清和癌组织中miR-335的相对表达量比较无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.3ROC曲线分析

2.3.1血清中miR-335对结直肠癌的诊断效能 由ROC曲线可知，其曲线下面积为0.837(95%CI：0.602～1.483)，诊断灵敏度为93.29%，特异度为80.71%，见图1。

2.3.2癌组织中miR-335对结直肠癌的诊断效能 由ROC曲线可知，其曲线下面积为0.901(95%CI：0.711～2.169)，诊断灵敏度为94.97%，特异度为82.35%，见图2。

表1 结直肠癌患者血清和癌组织中miR-335的表达与临床病理特征的关系

图1 血清中miR-335对结直肠癌的诊断效能ROC曲线

图2 癌组织中miR-335对结直肠癌的诊断效能ROC曲线

3 讨 论

miRNA可通过碱基互补配对原则与靶基因mRNA分子3'UTR特异性结合，降低靶基因稳定性或抑制其翻译，从而实现靶基因沉默，是基因转录后水平的重要调控方式〔8,9〕。有研究报道，多种miRNA在结直肠癌组织中表达异常，如miR-21〔10〕、miR-1011〔11〕、miR-200 b及miR-200c〔12〕，提示miRNA与结直肠癌的发生发展存在一定关系。由于结直肠癌早期症状较为隐匿，多数患者就诊时已为进展期，或失去手术治疗机会，其临床病死率呈逐年升高趋势〔13〕。因此，探究miRNA与结直肠癌发生进展的临床关系意义重大。miR-335作为一种肿瘤抑制因子，在乳腺癌、肝癌、肝内胆管癌、肺癌等多种肿瘤中表达下调，且与肿瘤的发生发展密切相关〔14〕。此外，miRNA还存在于人体血液中，外周血miRNA可作为一项肿瘤标志物。有学者研究报道，肝癌患者血清中miR-335表达水平降低，miR-335有望成为诊断肝癌的一个新的血清标志物〔15〕。另有学者研究报道，miR-335在乳腺癌血清肿表达稳定〔16〕，由此可见，临床对血清miR-335与恶性肿瘤的关系研究报道结果不尽一致。

本研究结果显示，miR-335在结直肠癌患者血清和癌组织中均呈低表达，且其表达水平与结直肠癌的发生发展密切相关。