申丽霞，郭吉兆，田海英，王红霞，许淑红，洪金华，邱建华*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2.浙江中烟工业有限责任公司宁波卷烟厂，浙江省宁波市奉化区葭浦西路2001 号 315040

3.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经济技术开发区第三大街9 号 450016

氨基酸是烟草中一类重要的含氮化合物，与烟叶品质密切相关［1-3］。卷烟燃吸时，氨基酸热解或参与美拉德反应产生部分烟气成分［4］，研究烟草氨基酸对烟气的影响对于调控卷烟烟气成分具有重要意义。许多研究采用高温热解实验模拟卷烟燃吸，根据热解产物推测氨基酸对卷烟烟气成分的影响，结果表明氨基酸热解可产生氰化氢、腈类、氨、吡啶类、吡咯类和吡嗪类等含氮化合物［5-7］。共存基质对氨基酸热解产物的种类、相对质量分数均有显著影响［8-9］，如：葡萄糖可促进天冬酰胺热解时氰化氢的生成、抑制氨的形成［10］；果糖和脯氨酸共热解产生1-羟基丙酮、吡咯烷、1-甲酰基吡咯烷、1-乙酰基吡咯烷等单独热解时不产生的化合物［11］。卷烟燃吸时多种组分共存，且卷烟燃吸时温度、气氛条件变化复杂，简单热解条件下所得热解产物与卷烟实际燃烧产生的有较大差异［12］。以同位素标记化合物进行卷烟添加，考察烟气中同位素标记成分的分布，不但可以使化合物热解条件与卷烟正常燃吸基本一致，同时由于同位素标记产物检测的高选择性，可采用较低的添加水平，避免对卷烟基质造成显著影响［13-14］。

缬氨酸在烤烟烟叶中的质量分数可高达769 μg/g［15］，是烤烟烟叶中质量分数较大的氨基酸。同时，缬氨酸也被国外烟草行业用作烟草添加剂［16］。本研究中以烤烟型卷烟为基质，通过在烟丝中添加13C5-15N-缬氨酸，采用GC/MS 法进行烟气分析，明确主流烟气中与缬氨酸相关的化学成分并确定量效关系，旨在明确缬氨酸对卷烟品质影响的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烤烟烟丝（产地：遵义；等级：C3F；年份：2016），该烟丝缬氨酸质量分数为325 μg/g；卷烟空筒［圆周：24.1 mm；长度：（24+60）mm；无滤嘴通风］。

13C5-15N-缬氨酸（98%，美国Sigma 公司）；D-(+)-葡萄糖、L-缬氨酸（99%，百灵威科技有限公司）；乙酸苯乙酯（98%，英国Alfa Aesar 公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国Avantor 公司）；甲醇（色谱纯，美国Dikma 公司）；苯-d6（99.5%，美国CIL公司）。

SM450-PC107 直线型吸烟机（英国Cerulean 公司）；5250T 热解仪（美国CDS 公司）；7890B/5977A气相色谱/质谱联用仪（美国Agilent 公司）；CPA225D 电子天平（感量0.000 01 g，德国Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

称取60 g 烟丝样品，在相对湿度（60±2）%、温度（22±1）℃的环境中平衡48 h。称取为烟丝实际质量分数4 倍的13C5-15N-缬氨酸，将其溶解于6.0 g 水中，然后将氨基酸溶液均匀喷洒于烟丝上。将上述烟丝样品装入自封袋，密封，平衡40 min；然后将其于110 ℃的烘箱中干燥2 min。将烘后的烟丝装入自封袋中，密封后冷却至室温，得到添加量为烟丝实际质量分数4 倍的同位素标记氨基酸烟丝样品。对照烟丝样品以空白烟丝添加同样量的水，采用相同的处理方式制作。

将烟丝置于相对湿度（60±2）%、温度（22±1）℃的环境中平衡48 h，手工卷制成烟支。每组样品中挑选吸阻范围为（平均值±49）Pa 和质量范围为（平均值±0.015）g 的烟支作为测试烟支。

1.2.2 烟气成分分析

烟气分析参考文献［14］的方法。按照ISO 标准条件［17］抽吸卷烟，采用44 mm 剑桥滤片、串联两个含有10 mL 甲醇的吸收瓶进行烟气粒相和气相成分捕集。卷烟抽吸结束后，采用含有内标（乙酸苯乙酯和氘代苯）的二氯甲烷溶液超声萃取粒相物，萃取液过0.45 μm 滤膜，将滤液用GC/MS 法分析烟气粒相成分。两个吸收瓶中分别加入含有相同质量分数内标的二氯甲烷溶液，各取1 mL 混合后，采用GC/MS 法分析烟气气相成分。质谱采集采用全扫描监测模式，扫描范围为25～400 amu。

1.2.3 热解实验

分别称取180 mg 葡萄糖、120 mg 缬氨酸，置入研钵中共研、混合均匀，作为葡萄糖和缬氨酸的混合物（摩尔比约为1∶1）。各称取0.92 mg 葡萄糖、0.97 mg 缬氨酸以及1.17 mg 葡萄糖-缬氨酸混合物，分别进行热解以及在线GC/MS 分析。热解条件：

2 结果与讨论

2.1 缬氨酸与卷烟主流烟气成分的定性关系

为确定13C5-15N-缬氨酸对卷烟主流烟气贡献的化学成分，按照不同质荷比逐个叠加对照样和13C5-15N-缬氨酸添加的实验样色谱图，叠加离子质量数范围为30～200 amu，记录实验样与对照样相比有增加的离子，并记录对应的保留时间。根据对照样对应的保留时间质谱图，采用NIST14 谱库定性对应化合物。以2-甲基丙醛为例，对缬氨酸相关烟气成分的定性进行方法描述。选择实验样和对照样的色谱图，叠加每个质荷比选择离子色谱图（图1）。在保留时间14.4 min 处发现，与对照样相比，实验样m/z=76、46、44、29 等离子的丰度大幅增加。表明保留时间14.4 min 处的化合物与13C5-15N-缬氨酸相关。

图1 实验样（添加有13C5-15N-缬氨酸）与对照样在14.4 min 处叠加色谱图Fig.1 Overlaying chromatogram of experimental samples(spiked by 13C5-15N-valine)and the control at retention time of 14.4 min

图2a 为对照样14.4 min 处色谱峰的质谱图，以NIST14 谱库定性，表明该化合物为2-甲基丙醛。比较对照样和实验样保留时间14.4 min 处对应成分的质谱图（图2）可以发现，实验样质谱图中m/z=76、46、44、29 的相对丰度大幅增加。2-甲基丙醛的分子离子峰为m/z=72，主要碎片离子m/z=43、41 和27，分别对应于［M-HCO］+、［M-CH3O］+和［C2H5］+；实验样中m/z=76（72+4）、46（43+3）、44（41+3）和29（27+2）分别对应于这4 个离子的同位素标记离子。因此可以推测，实验样卷烟主流烟气中增加的2-甲基丙醛为13C4标记，4 个碳原子均来自缬氨酸分子。

图2 对照样（a）和实验样（b）主流烟气2-甲基丙醛的质谱图Fig.2 Mass spectra of 2-methylpropanal in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

图3 是对照样和实验样主流烟气中甲基吡嗪（C5H6N2）的质谱图。对照样中甲基吡嗪的分子离子峰为m/z=94，m/z=95 对应于天然同位素的分子离子峰。实验样中m/z=95 的相对丰度明显增加；同时m/z=68 相对m/z=67 略有增加。表明实验样卷烟主流烟气中增加了同位素标记的甲基吡嗪。

图3 对照样（a）和实验样（b）主流烟气中甲基吡嗪的质谱图Fig.3 Mass spectra of methylpyrazine in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

图4 是对照样和实验样2-环戊烯-1-酮（C5H6O）的质谱图。对照样显示2-环戊烯-1-酮的分子离子峰为m/z=82。实验样中m/z=85 的离子相对丰度显著增加，对应于M+3 的同位素分子离子峰。对应地，实验样中m/z=84、55 等离子均比对照样略有增加。由此可以推测，实验样卷烟主流烟气中增加了2-环戊烯-1-酮，且只有3 个碳原子来自缬氨酸。

图4 对照样（a）和实验样（b）主流烟气中2-环戊烯-1-酮的质谱图Fig.4 Mass spectra of 2-cyclopenten-1-one in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

除了2-甲基丙醛、甲基吡嗪、2-环戊烯-1-酮外，还发现实验样烟气中增加了全13C 标记的3-甲基丁酸、异丁烷和2-甲基-1-丙烯等，表明缬氨酸对烟气中这3 种化合物的形成有一定贡献。这6 种化合物的分子式、主要质谱离子和13C5-15N 标记缬氨酸实验样质谱图中主要增加的离子见表1。

需要说明的是，缬氨酸在卷烟燃吸时热解、燃烧可能形成的CO、CO2、氨、氰化氢等小分子成分在本分析方法中均无法覆盖。

2.2 缬氨酸与卷烟主流烟气成分的量效关系

为了确定缬氨酸与上述6 种化合物的量效关系，分别选择非标记和同位素标记化合物定量离子，以非标记定量离子峰面积与内标峰面积比值定量对照样中各化合物的释放量；以同位素标记定量离子峰面积与内标峰面积比值的增量定量实验样中同位素标记化合物的释放量。依据添加实验结果可估算烟丝中缬氨酸对烟气化合物的贡献率（%）：

表1 与缬氨酸相关的卷烟烟气化学成分Tab.1 Contribution of valine to cigarette smoke components

R=［(Y/A)×C0］/Y0

式中：Y 为实验样同位素标记化合物释放量，μg/支；A 为氨基酸添加量，μg/g；C0为烟丝中氨基酸质量分数，μg/g；Y0为对照样化合物释放量，μg/支。

缬氨酸对6 种化合物的估算贡献率结果见表2，表2 中实验样化合物释放量为同位素标记化合物的释放量。缬氨酸对烟气2-甲基丙醛的贡献率最大，达69%；对3-甲基丁酸、甲基吡嗪、异丁烷、2-甲基-1-丙烯、2-环戊烯-1-酮的贡献率均小于5%。

表2 缬氨酸对卷烟主流烟气中6 种化合物的估算贡献率Tab.2 Estimated contribution rates of valine to 6 compounds in mainstream cigarette smoke

2.3 形成机制

分别对缬氨酸、葡萄糖和缬氨酸-葡萄糖混合物（摩尔比约为1∶1）进行热解，初步探讨缬氨酸促进烟气6 种成分形成的机制，结果见表3。缬氨酸热解产物中检测到2-甲基丙醛和2-甲基-1-丙烯，葡萄糖热解产物中6 种化合物均没有检出，缬氨酸/葡萄糖混合物中检出2-甲基丙醛、甲基吡嗪、异丁烷和2-甲基-1-丙烯。2-甲基丙醛在缬氨酸热解产物中归一化面积达22.12%，为缬氨酸的主要热解产物，而且在缬氨酸-葡萄糖混合物的热解产物中2-甲基丙醛峰面积和归一化面积均显著增加，表明葡萄糖的存在促进了缬氨酸热解形成2-甲基丙醛。

缬氨酸单独热解可以通过分子内脱氨、脱CO形成2-甲基丙醛［18］，如图5 所示。在葡萄糖存在下，缬氨酸可通过Strecker 降解反应形成2-甲基丙醛［19］，即缬氨酸与Maillard 初级反应产物α-二酮反应形成Schiff 碱，然后经重排、脱羧和水解产生比缬氨酸少一个碳原子的2-甲基丙醛，如图6所示。缬氨酸添加至卷烟中，经燃烧产生2-甲基丙醛应该是两种机制共同作用。氨基酸与糖热解相互作用形成了甲基吡嗪、异丁烷。在热解产物中并没有检测到3-甲基丁酸和2-环戊烯-1-酮，表明这两种化合物的形成可能与烟草其他基质成分相关。

表3 缬氨酸、葡萄糖及其混合物热解产物中6 种化合物的峰面积Tab.3 Peak areas of 6 compounds in pyrolysates of valine,glucose,and their mixture

图5 缬氨酸直接热解形成2-甲基丙醛的机理[18]Fig.5 Mechanism of formation of 2-methylpropanal from pyrolysis of valine

图6 葡萄糖促进缬氨酸热解产生2-甲基丙醛的机理[19]Fig.6 Mechanism of formation of 2-methylpropanal from pyrolysis of valine in the presence of glucose

2.4 感官作用

以对照卷烟为空白，分别添加约50、100、200、300、500 μg/g 缬氨酸进行感官评价。结果显示，添加50 μg/g 的缬氨酸对烟气感官没有明显影响；随着缬氨酸添加量增加，烟气中坚果香和烤烟香韵增加，烟气浓度增加。500 μg/g 添加量的烟气过浓、刺激明显。对于该烟丝来说，适宜的添加量应该在100～300 μg/g 之间。2-甲基丙醛具有甜的、巧克力味，可增加烟气丰满度；缬氨酸具有甜的、坚果香、烤烟香韵［20］，两者对卷烟香气的影响基本一致。结合量效关系研究可以推断，烟草中缬氨酸对烟气香气的贡献主要来自烟气2-甲基丙醛释放量的增加。2-甲基丙醛也被用作烟草添加剂［16］，但其沸点仅为64 ℃，在使用过程中容易散失，因此，可以采用不挥发的缬氨酸替代2-甲基丙醛作为烟草添加剂。

3 结论

卷烟添加稳定同位素标记缬氨酸研究缬氨酸与相关主流烟气成分的定性关系和量效关系的结果表明：①缬氨酸与烟气中2-甲基丙醛、异丁烷、甲基吡嗪、3-甲基丁酸、2-环戊烯-1-酮和2-甲基-1-丙烯等化合物的形成有关。②缬氨酸对2-甲基丙醛的贡献率最大，达69%，对异丁烷、甲基吡嗪、3-甲基丁酸、2-环戊烯-1-酮、2-甲基-1-丙烯的贡献率均小于5%。③缬氨酸对烟气香气的影响主要来自缬氨酸自身热解和Strecker 降解产生的2-甲基丙醛。