迟广俊，柴国璧，李小斌，张启东，刘俊辉，毛 健，史清照，王丁众，姬凌波，李希强，宁 伟，韩国阳，赵新玉，毛 华，范 武*

1.红塔辽宁烟草有限责任公司，沈阳市和平北大街26 号 110001

2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

3.陕西中烟工业有限责任公司技术中心，陕西省宝鸡市高新大道100 号 721013

吲哚和3-甲基吲哚是一类具有复杂气息的苯并吡咯类化合物，在香味化学领域具有广泛的用途。调香师常用吲哚和3-甲基吲哚展示人类嗅觉系统奇妙的运行机制：纯的或高浓度的吲哚及3-甲基吲哚带有强烈的粪臭气息，当浓度低于某一临界值时，二者的嗅觉特征开始发生转变，吲哚表现出接近茉莉花香的香气，3-甲基吲哚则展现出花香和大灵猫香样的动物香，该临界值也即吲哚和3-甲基吲哚的嗅觉特征转变浓度。吲哚和3-甲基吲哚在自然界分布广泛，在茉莉花精油［1］、茶叶［2-4］、咖啡豆［5-7］、黄油［8］、奶酪［9］、白酒窖泥［10］、白酒［11］、肉类［12-14］等具有完全不同嗅觉特征的体系中，均发现了吲哚或3-甲基吲哚。由于基质、质量分数、嗅觉特征转变浓度以及与其他成分之间可能存在的协同作用等因素影响，吲哚和3-甲基吲哚在某些体系中被认为是重要的致香成分［1-4］，而在另一些体系中则被认为会带来严重的感官缺陷［11-14］。

吲哚和3-甲基吲哚在烟叶［15-18］及卷烟烟气［19］中也普遍存在，但对其在卷烟中的感官作用却有不同的研究报道。王玉华等［15］认为烤烟自然醇化过程中所产生的吲哚，对卷烟的余味和刺激性产生了显著正面影响；许春平等［16］认为添加以3-甲基吲哚等为特征致香成分的烟草浸膏可以明显提升卷烟的整体品质；刘善民等［17］认为晒红烟中的吲哚对杂气有正面效应；而于建军等［18］却认为吲哚对烤烟烟气的香气质、香气量均有显著的负面影响。目前，对于吲哚、3-甲基吲哚在卷烟中的香味作用仍无定论，且大多数研究主要采用统计分析方式获得烟叶中吲哚、3-甲基吲哚质量分数与评吸结果的相关性，鲜见针对二者在卷烟烟气中浓度与香气特征关系的直接分析。卷烟的感官品质主要取决于烟气中的香味物质，食品感官组学领域通常利用香味物质的质量分数和阈值之比，即香气活性值（Odor activity value，OAV）判定其对产品香味特征的贡献程度［20］。鉴于此，本研究中系统测定了不同卷烟主流烟气粒相物中吲哚和3-甲基吲哚的质量分数，测定其在两种不同极性溶剂中的嗅觉阈值和嗅觉特征转变浓度，计算相应的香气活性值，并讨论其对卷烟烟气香气特征的作用，旨在为改进卷烟调香技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

实验用卷烟样品为14 个市售品牌成品卷烟；烟草添加剂安全性评估参比卷烟（上海烟草集团有限责任公司）。

吲哚（99%）、3-甲基吲哚（96%）（百灵威科技有限公司）；四甲基吡嗪［＞98%，Alfa Aesar（中国）化学有限公司］。

5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；SM450 型20 孔道吸烟机（英国Cerulean 公司）；CP224S 型分析天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）44 mm 剑桥滤片（英国Whatman公司）；HY-5 型振荡器（浙江金坛中大仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 主流烟气粒相物收集和样品准备

挑选质量范围为（0.864±0.020）g、吸阻范围为（1 080±50）Pa的卷烟，保持环境温度为（22±1）℃，相对湿度为（60±2）%，平衡48 h。按ISO3308［21］和GB/T 19609—2004［22］的方法抽吸烟支，每一滤片收集5 支烟的主流烟气粒相物。将两张已收集烟气粒相物的滤片置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入20 mL 内标溶液（1 μg/mL 四甲基吡嗪的乙醇溶液），室温振荡30 min。取1 mL 上清液进行GC/MS分析，每个样品测定2 次，取平均值。分析条件：

色谱柱：DB-WAXetr（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；载气：He；柱流量：1 mL/min；分流模式：不分流；程序升温：50 ℃（0 min）传输线温度：250 ℃；电离方式：EI；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：选择离子扫描。待测化合物保留时间、定性及定量离子的参数选择见表1。

表1 吲哚和3-甲基吲哚的保留时间和选择离子表Tab.1 Retention times and selected ion parameters of indole and 3-methylindole

1.2.2 嗅觉阈值和嗅觉特征转变浓度的测定

按照GB/T 22366—2008［23］中针对最优估计阈值（Best estimate threshold，BET）法测定风味物质阈值的方法，选择10 位身体健康、无任何感官方面缺陷、无明显体味的人员，采用三点选配法（3-AFC）分别测定待测物在乙醇和三乙酸甘油酯中的嗅觉阈值。将吲哚、3-甲基吲哚分别配制成1 mg/mL 的乙醇和三乙酸甘油酯溶液，并逐级等比例稀释20 次，稀释因子为2，分别获得两种溶剂中二者浓度等比例降低的系列溶液；对于每个浓度的溶液，均要求评价人员从1 个溶液和2 个空白中辨识出该溶液，并描述所识别出的溶液的嗅觉特征。对每一个待测物质，以每位评价人员辨识错误的最高浓度和其紧邻的更高一级浓度的几何平均值作为该评价人员评价该物质的BET 值；再分别计算10 位评价人员对每个待测物BET 值的几何平均值，将其作为待测物的嗅觉阈值。

对每一个待测物，将每位评价人员描述为粪臭的最低浓度和描述为花香的最高浓度作为该评价人员评价该物质嗅觉特征发生转变的浓度范围，从10 个描述为粪臭的最低浓度中选取一个最大值，从10 个描述为花香的最高浓度中选取一个最小值，以此作为待测物的嗅觉特征转变浓度范围。目前并没有测定某一物质嗅觉特征转变浓度的标准方法，因此本研究中选取上述的浓度范围，从而保证吲哚和3-甲基吲哚的转变浓度在上述方法测定的浓度范围内。事实上，以烟气粒相物中吲哚和3-甲基吲哚的质量分数为依据，配制成同样质量分数的乙醇和三乙酸甘油酯溶液，经评价人员嗅闻后，确认二者皆为明显粪臭气息，说明该方法适用于本研究。

1.2.3 卷烟样品中待测物的香气活性值

以14 种卷烟样品主流烟气粒相物中待测物在粒相物中的质量分数与其嗅觉阈值的比值，作为该物质的OAV 值［20］。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的建立

分别考察了DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-WAXetr（60 m×0.25 mm×0.25 μm）两种色谱柱对待测物的分离效果。结果表明，使用DB-WAXetr 色谱柱，在标准溶液及烟气样品中，2种待测物的GC/MS 基线可实现分离，且峰型较好，整个分析过程可在19 min 内结束；而使用DB-5MS 色谱柱时峰形较差。

2.2 定量分析方法的验证结果

本研究中采用内标法定量，以各待测物的浓度与内标浓度之比为横坐标，待测物与内标的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，2 种待测组分的线性范围、回归方程和相关系数见表2。在相同条件下对参比卷烟烟气样品平行测定6 次，计算2 种物质测定的RSD。将最低浓度的标准溶液测定6次，以其3 倍标准偏差作为方法的检测限、10 倍作为方法的定量限。结果表明，方法的线性回归系数均大于0.999，各测定值的RSD 均小于10%，线性和重复性良好，适合进行定量分析。2 种待测物3 水平的加标回收率见表3，目标物的回收率在100%～110%之间，说明本方法的测定结果较准确。

表2 两种待测物的工作曲线、检测限、定量限及RSDTab.2 Working curves,limits of detection,limits of quantification and RSDs for 2 analytes

表3 两种待测物的回收率和RSDTab.3 Spiked recoveries and RSDs for 2 analytes

2.3 主流烟气粒相物中待测物质量分数

采用本方法分别检测了14 种成品卷烟烟气中吲哚和3-甲基吲哚的释放量，表4 为两种待测物的单支卷烟烟气释放量和在主流烟气粒相物中的质量分数。从表4 中的检测结果可以看出，吲哚和3-甲基吲哚在部分混合型卷烟中的单支释放量和主流烟气粒相物中的质量分数较高，且明显高于其他卷烟。

烟气中含氮化合物不仅种类和数量丰富，而且由于碱性的强弱，其可能会呈现出多种形态，从而对卷烟感官品质产生影响。例如，烟碱可与质子结合，以游离态和单质子态分布在烟气中，其中烟气游离烟碱与卷烟劲头密切相关，游离烟碱释放越高，劲头越大［24］。考虑到吲哚和3-甲基吲哚均具有烯胺结构，其3-位碳可在酸性环境中发生质子化［25］。在HClO4溶液中，质子化吲哚的pKa值约为-3.6［26］，质子化3-甲基吲哚的pKa值约为-4.55［26］。由此可见，吲哚和3-甲基吲哚是一类碱性极弱的氮杂环化合物，在相对弱酸性的烟气环境中处于游离状态。因此两种物质的检测结果较为真实地反映了烟气中二者的实际释放量水平。

表4 两种待测物在14 种卷烟样品主流烟气中的释放量分布Tab.4 Releases of 2 analytes in mainstream smoke of 14 cigarette samples

2.4 嗅觉阈值测定和OAV 计算结果

在不同极性的介质中，香气成分往往具有不同的嗅觉阈值。卷烟烟气粒相物成分复杂，仅使用一种介质很难模拟其极性。烟气粒相物中的水溶性成分（极性较强）约占1/3，剩下的部分则为油溶性成分（极性较弱）［27］。考虑到介质的安全性以及避免阈值测定中介质自身感官特征所带来的干扰，分别以乙醇和三乙酸甘油酯作为不同极性介质的代表，以获得待测物在强、弱两种极性介质中的嗅觉阈值。鉴于吲哚、3-甲基吲哚的嗅觉特征随其浓度的变化而有所不同，本研究中进一步评价了两种物质在上述介质中的嗅觉特征。如表5所示，无论是在乙醇还是三乙酸甘油酯中，3-甲基吲哚的嗅觉阈值均明显低于吲哚；两种物质在乙醇中的嗅觉阈值均低于各自在三乙酸甘油酯中的阈值。此外，当吲哚在乙醇、三乙酸甘油酯中的浓度分别介于3.45～6.90 μg/g 和13.81～27.63 μg/g 时，嗅觉特征开始由花香向粪臭气息转变，随着浓度的升高粪臭气息愈发明显而无花香；相比之下，3-甲基吲哚在两种介质中的嗅觉转变浓度均更低。

表5 两种待测物在乙醇和三乙酸甘油酯中的嗅觉阈值及嗅觉特征转变浓度Tab.5 Olfactory thresholds and critical concentrations at which olfactory characteristics changed for 2 analytes in ethanol and triacetin solutions

根据吲哚、3-甲基吲哚在卷烟烟气粒相物中质量分数及其在两种介质中的嗅觉阈值，分别计算两种物质在14 种卷烟样品烟气中的OAV（表6）。可以看出，无论是以强极性或是弱极性溶剂为介质，吲哚和3-甲基吲哚的OAV 均大于1，且后者的OAV 远高于前者。根据OAV 的定义，可以推测吲哚和3-甲基吲哚均能影响卷烟烟气的香气特征，且3-甲基吲哚的作用更加显著。不考虑在卷烟烟气气相部分的分布量，两种成分仅在主流烟气粒相物中的质量分数（表4）已远高于各自的嗅觉特征转变浓度（表5），因此二者在烟气中应当表现为粪臭气息。然而在卷烟燃吸过程中，吲哚、3-甲基吲哚所固有的粪臭气息在烟气中并不容易被消费者感受到，其原因可能是由于烟熏香气可以有效掩盖粪臭气息［28］，而烟熏香也是卷烟烟气中的一种十分强烈的香韵［29］。事实上，利用烟熏香掩盖吲哚、3-甲基吲哚所带来的不良气息是食品调香中的常用方法。例如，3-甲基吲哚通常被认为是猪肉膻味的主要来源，可对猪肉风味产生不利影响，而利用烟熏香技术则可以有效控制猪肉膻味。有研究报道，脂肪中3-甲基吲哚的质量分数分别达0.4 mg/kg 和0.89 mg/kg 的猪肉和香肠的膻味，可以使用液体烟熏剂掩盖［30-31］。由于烟气中的烟熏香成分多为酚类物质［29］，在口腔中容易通过氢键作用与蛋白结合［32］，这可能导致其失去掩盖不良气息的能力。因此认为吲哚和3-甲基吲哚在口腔内的累积可能是造成卷烟长期消费者口腔具有异味的重要原因。

表6 14 种卷烟样品主流烟气中两种待测物的香气活性值Tab.6 OAVs of 2 analytes in mainstream smoke of 14 cigarette samples

3 结论

①3-甲基吲哚在乙醇和三乙酸甘油酯中的嗅觉阈值远低于吲哚；随着浓度的升高，二者的嗅觉特征由花香转变为粪臭气息。②从吲哚和3-甲基吲哚的单支卷烟烟气释放量及在烟气粒相物中质量分数来看，混合型卷烟明显高于烤烟型卷烟。③通过OAV 值反映出吲哚和3-甲基吲哚对烟气香气皆有影响，且以3-甲基吲哚作用更明显。④分别比较吲哚、3-甲基吲哚在烟气粒相物中质量分数与其在两种介质中的嗅觉特征转变浓度可知，其在烟气中表现为粪臭气息，但由于烟熏香的掩盖作用，二者的粪臭气息并不易被卷烟消费者感受到，然而其在口腔内的累积可能是造成卷烟长期消费者口腔具有异味的重要原因。