赵立君,刘云根,王 妍*,赵 蓉,李 波,郑 毅

砷污染湖滨湿地底泥微生物群落结构及多样性

赵立君1,刘云根2,王 妍2*,赵 蓉2,李 波1,郑 毅1

(1.西南林业大学湿地学院,云南 昆明 650224；2.西南林业大学生态与环境学院,云南 昆明 650224)

为研究高原砷污染湖滨湿地底泥微生物群落结构及多样性特征,探寻底泥砷含量及砷形态与微生物之间的联系,采集云南省阳宗海东、西、南、北岸湖滨湿地底泥样品,利用16S rRNA高通量测序技术,研究了砷污染湖滨湿地底泥微生物丰富度特征,探讨了不同砷形态差异对微生物群落的影响.结果显示,底泥砷含量对微生物丰富度影响显著,砷含量高的南岸区域微生物的丰富度较高,OTU为1286~1473.而砷含量较低的西岸区域微生物丰富度也随之较低,OTU为693~1339.阳宗海湖滨湿地底泥微生物群落结构稳定,主要优势类群为Proteobacteria(变形菌门,15.6%~59.6%)、Chloroflexi(绿弯菌门,10.1%~44.9%)及少量的Actinobacteria(放线菌门)和Acidobacteria(酸杆菌门).底泥中砷形态主要以残渣态砷(F5)和无定型氧化物结合态砷(F3)为主,无定型氧化物结合态砷(F3)对底泥微生物类群影响最为显著.同时,底泥中生物有效态砷(非专性吸附态砷+专性吸附态砷+无定型氧化物结合态砷)占到19.3%~58.6%,存在环境释放风险.研究结果加深了对砷污染高原湖泊底泥中微生物群落的认识,为湖泊砷污染防治提供微生物治理的理论基础和科学依据.

砷污染；湖滨湿地；底泥；砷形态；微生物群落

高原湖泊流域具有面积小、补给水源有限、换水周期长、水环境容量低等特点,面临极高的污染风险[1-3],逐渐成为研究热点.湖滨湿地是拦截外源污染物的有效屏障,也是污染物的重要储库,该关键区域中微生物转化、底泥吸附与解吸、湿地植物吸收等与污染物生物地球化学过程相关的作用直接决定污染物的水环境风险[4-5].云南省九大高原湖泊之一的阳宗海曾遭受严重的水体砷污染,整个湖泊水体中砷含量达0.13~0.19mg/L,超过地表水环境质量标准Ⅴ类水标准值(0.1mg/L).水体加入絮凝剂治理后,水体砷浓度显著降低,湖泊底泥成为砷的蓄积体,浓度为10.28~81.54mg/kg[6-7].

砷是自然界广泛存在元素,在底泥中的赋存形态决定其毒性效应和生态风险[8-9].研究显示[10-11],污染物在底泥中的迁移转化过程与微生物活动密切相关,重金属进入底泥环境后,会对微生物多样性及群落结构产生影响.同时微生物介导的砷和磷形态转化速率和程度均显著强于化学过程[12-14],是湖滨湿地污染物环境行为和风险研究不可忽视的重要过程.关于微生物与砷形态转化关系的研究对象大多集中于矿区、地下含水层和农田等与人体健康关系密切的土壤/底泥环境[15-16],相关研究发现砷污染对微生物群落分布的多样性、优势度和均匀度均有显著影响,然而目前有关砷污染湖滨湿地微生物研究报道尚少.本研究旨在研究砷污染湖滨湿地底泥微生物群落结构及多样性特征,探讨砷含量及砷形态对微生物的影响,找寻高效抗砷菌种,以期为高原湖泊砷污染防治提供微生物治理理论基础和科学依据.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

阳宗海(24°51'~24°58'N,102°58'~103°01'E)地处云南省昆明市境内,属于高原断陷淡水湖泊.湖面呈纺锤形,东西宽2.5km,南北长12.7km,湖面面积31.9km2.2008 年阳宗海发生了砷污染事件而备受关注.经治理以来,阳宗海水体砷污染已得到有效控制,一部分砷随絮凝剂进入底泥环境中,对其中微生物产生深刻影响.

1.2 样品采集与处理

采样点位置如图1所示,2017年7月下旬,选取阳宗海湖滨湿地东、西、南、北岸湖滨区域采集样品,共布设4条样带,每条样带设距湖岸5m的近岸点和距湖岸15m的远岸点.分别为:阳宗大河汇入的南岸区域(S),近岸点为S1,远岸点为S2;村落聚集的西岸区域(W),近岸点为W1,远岸点为W2;捕鱼活动较多的沙质岸滩北岸区域(N),近岸点为N1,远岸点为N2;地处山崖附近环境相对稳定的东岸区域(E),近岸点为E1,远岸点为E2.

所有采样点均用全球定位系统GPS(佳明GPS72)定位.用有机玻璃柱状底泥分层采样器采集湖滨湿地表层底泥(1~10cm).每个样点采集3个平行底泥样品.样品存放在-80℃冰箱保存,一部分送往上海美吉生物公司进行高通量测序工作.另一部分经真空冷冻干燥,研磨、过筛(100目)备用.

图1 采样点分布

1.3 理化指标测试及分析方法

测定的理化指标包括:底泥总磷(TP)采用钼锑抗分光光度法[17]，底泥总砷(TAs)采用(3:1)王水消解提取[18]测定,砷形态采用Wenzel等[19]的连续五步提取法提取(见表1).其中,非专性吸附态(F1)、专性吸附态(F2)和无定型氧化物结合态(F3)在底泥中具有较高的活性,为生物有效态砷;后两种结合态砷生物可利用性较低,在底泥中较为稳定,为非生物有效态砷.总砷及各形态砷的含量均使用AFS-810双道氢化物发生原子荧光分光光度计(北京吉天)测定;所有样品处理测定过程均同时带试剂空白、平行样.

表1 样品砷形态的提取方法

1.4 样品16Sr RNA基因测序

底泥16S rRNA的测序工作由上海美吉生物信息科技有限公司完成,以FastDNA Spin Kit for soil DNA(美国Mpbio公司)提取试剂盒对样本的基因组DNA进行提取.选择V3~V4可变区,以稀释的基因组DNA为模板,使用338F(5’-ACTCCTACGGG- AGGCAGCAG-3’)-806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[20]引物和高效高保真酶进行PCR,确保扩增效率和准确性.使用TruSeq™ DNA Sample Prep Kit(美国Illumina公司)建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库经过QuantiFluor™-ST(美国Promega公司)定量,文库合格后使用MiSeq PE300(美国Illumina公司)进行上机测序.然后对所以样品的全部序列进行聚类,以97%的相似度将序列聚类成OTU,然后对OTU的代表序列进行物种注释,确定16S rRNA序列对应的微生物名称.

1.5 生物信息处理

首先对测序得到的原始数据进行拼接、过滤,得到有效数据[21].然后基于有效数据进行OTU聚类和物种分类分析,并将OTU和物种注释结合,从而得到每个样品的OTU和分类谱系的基本分析结果.再对OTU进行丰度、多样性指数等分析,同时对物种注释在门分类水平上进行群落结构的统计分析.在以上分析的基础上,进行基于OUT的主成分分析(PCA)并结合环境因素进行冗余分析(RAD)等比较分析,揭示微生物在砷污染环境中的响应特征.

2 结果与分析

2.1 砷污染底泥分析

阳宗海湖滨湿地底泥总砷及各砷形态含量如表2所示:阳宗海4组岸带底泥中的砷含量均较高,在15.90~34.09mg/kg之间,超全国水系沉积物背景值[22]2倍以上.其中南岸最高,底泥中总砷含量达到了34.09~34.56mg/kg,其次为西岸和东岸,北岸底泥砷含量最低,为15.90~22.17mg/kg.

表2 样品总砷、总磷及砷形态统计

注:F1:非专性吸附态砷 F2:专性吸附态砷 F3:无定型氧化物结合态砷 F4:晶型铁氧化物结合态砷 F5:残渣态砷.

底泥砷形态含量规律较为相似,以残渣态砷(F5)含量最多,其次为无定型氧化物结合态砷(F3)、晶型铁氧化物结合态砷(F4)和专性吸附态砷(F2)而非专性吸附态砷(F1)含量最少.组成上看,生物有效态砷(F1+F2+F3)和非生物有效态砷(F4+F5)均占底泥总砷的1/2左右,底泥环境存在砷释放的风险.非专性吸附态砷易被植物吸收利用,占总砷比例较小.专性吸附态砷和无定型氧化物结合态砷在土壤条件发生变化时容易发生改变,进而转化成为有效态砷释放出来.晶型铁氧化物结合态砷和残渣态砷不易被生物吸收利用,对环境的危害和风险较小.阳宗海曾使用絮凝剂沉淀湖泊中的砷,部分砷随絮凝剂进入底泥富集,造成底泥中残渣态砷的含量较高.

阳宗海4条样底泥中总磷含量差异明显,南岸底泥中总磷含量最高,为933.26~998.26mg/kg,其次为北岸和东岸,西岸底泥中总磷含量相对较少,底泥总磷含量为290.09~415.78mg/kg.

阳宗海湖滨湿地底泥总磷含量与各样带地理位置有关,南岸湖滨湿地为阳宗大河汇入区,伴随着大量的营养物质,促使南岸底泥中的总磷含量明显高于其他3个岸.砷和磷属于同主族元素,化学性质和化学行为相似,均可以通过专性吸附的方式被土壤胶体和土壤中铁铝氧化吸附固定,因此砷和磷的竞争关系是影响砷吸附的重要原因之一[23].

2.2 砷污染湖滨湿地底泥微生物多样性特征

利用多样性指数对阳宗海底泥4组岸带底泥中微生物多样性进行分析,结果如表3所示:得到有效序列总计213039条.S1样品包含19338条(1473个OTU),S2样品包含22655条(1286个OTU), N1样品包含26597条(1136个OTU),N2样品包含30722条(1188个OTU),W1样品包含27672条(693个OTU),W2样品包含28439条(1339个OTU),E1样品包含24699条(1136个OTU),E2样品包含34046条(1353个OTU).分属41门、97纲、192目、336科、564属、996种.

为分析底泥微生物多样性差异,本研究采用Chaol指数、Shannon指数和Simpson指数(表3)表征微生物的丰富度和群落多样性.结果表明:南岸底泥微生物OTU为1286~1473,丰富度最高.西岸底泥微生物OTU为693~1339,丰富度最低,近远岸点之间的微生物OTU相差93%,微生物丰富度差异较大.Chaol指数反映样本中微生物丰富度、Shannon指数和Simpson指数反映样本中微生物的多样性,Shannon值越大,说明群落多样性越高,Simpson指数值越大,说明群落多样性越低.多样性指数结果表明,S1样点的微生物丰富度和多样性均为最高.W1样点最低.北岸和东岸底泥微生物丰富度从近岸至远岸均有小幅增加.Coverage指数是指各样本文库的覆盖率,其数值越高,则样本中序列被测出的概率越高.所有样品的Coverage指数均在0.989以上.反映本次测序结果代表了样本中微生物的真实情况.

表3 样品OTU及多样性指数

利用韦恩图可以比较直观的表现环境样本的物种数目组成相似性及重叠情况(见图2).结果表明:阳宗海的4条样带底泥微生物OUT为1498~1605,而共有OTU高达852,占各条样带OTU的一半以上,表明阳宗海底泥中微生物群落组成基本相似.南岸样带的特有OTU为40;东岸样带的特有OTU为85;西岸样带的特有OTU为31;北岸样带的特有OTU为157.由于北岸湖滨底泥中砷含量为4个岸中最低,致使底泥中的特有微生物受影响较小,特有OTU较高.而在砷含量较高的区域,耐砷优势微生物占据群落主导,特有微生物相对较少.

湖泊底泥是一个由多种生物和非生物参与的、物质频繁交换的有机、无机混合体.外界营养物质的输入及环境条件的改变等因素都会影响微生物群落[24].微生物对重金属污染的响应存在差异,有研究表明[25]高浓度的重金属会对微生物产生胁迫效应,使其生物量降低.是由于高浓度的重金属会破坏细胞结构和功能,加快细胞的死亡,抑制微生物的活性或竞争能力从而降低生物量;同时,在重金属胁迫条件下,微生物需要消耗大量能量以抵御环境胁迫.韩永和等[26]研究发现,砷胁迫会降低16S rRNA基因丰度、减少微生物数量.但也有研究[27-28]指出低浓度的重金属污染能够促进微生物的生长繁殖,提高细胞活性和增加生物量.国外学者Giller等[29]认为重金属胁迫对微生物多样性的影响并不是呈线性的,而是呈现拱桥形,低剂量的重金属胁迫抑制优势种群的竞争性排除效应,有利于劣势种群的生存,导致微生物多样性增加.

图2 样品OUT分布韦恩图

阳宗海湖滨湿地底泥微生物的丰富度特征呈现空间异质性.在底泥砷、磷含量最高的南岸区域,微生物的丰富度最高,而在砷、磷含量均较低的西岸,微生物的丰富度最低.表明一定的砷胁迫环境有利于底泥微生物的生长繁殖,微生物更趋向于生活在砷、磷含量较高的底泥环境.微生物的丰富度也受到砷形态的影响,底泥中非生物有效态砷高,其中的微生物丰富度也相对较高.

2.3 砷污染湖滨湿地底泥微生物群落组成特征

利用Mothur方法[30]与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1),获得门水平上分类学信息,统计各样本的群落组成(见图3).研究结果显示：阳宗海底泥微生物群落组成稳定,但近远岸之间存在着差异.在门分类水平上,微生物群落主要以Proteobacteria(变形菌门)和Chloroflexi(绿弯菌门)为主,含有少量的Actinobacteria(放线菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)和Firmicutes(厚壁菌门).变形菌门在阳宗海湖滨湿地底泥的比重为15.6%~59.6%,绿弯菌门比重为10.1%~44.9%,为阳宗海湖滨湿地底泥中优势菌门.南岸、西岸和东岸从近岸至远岸区域变形菌门比重均有一定程度上升,而北岸地区由近岸至远岸变形菌门比重下降,绿弯菌门比重上升.

本研究利用主成分(PCA)分析.通过分析不同样本群落组成可以反映样本间的差异和距离(见图4).结果显示:轴1(PC1)贡献值为57.42%,轴2（PC2）贡献值为20.44%,总贡献值为77.86%.在阳宗海湖滨湿地中,东岸底泥微生物群落相似度最高,其次为南岸样带,北岸样带和西岸样带相似度较低.东岸由于地处断崖,环境较为封闭、稳定,受到的干扰较小,同时底泥中非生物有效态砷的比例较高,促使东岸底泥微生物群落相似度高,群落结构稳定.

图3 门水平微生物群落组成

微生物与湖泊底泥环境相互作用,一方面微生物对湖泊底泥中营养物质循环和化合物降解起着重要的作用,另一方面湖泊底泥也为微生物的各种代谢活动提供场所,底泥中各种环境因子的变化[31]都会影响底泥微生物群落的组成和结构.砷作为一类胁迫因子和选择压力,影响底泥中微生物生理代谢过程、存活、对环境的适应及其所发挥的生态功能.

图4 样品PCA分析

底泥微生物群落作为湖泊生态系统稳定性的重要敏感性指标,稳定多样的微生物种群是适应外界因素和维持湖泊生态的必要因素.砷污染会对微生物固有的群落结构和活性造成不利影响[32].微生物若长期处在砷污染的环境中,群落结构会发生变化,导致物种多样性减少,大部分敏感的物种逐渐消失,而关键代谢活动(重金属抗性)较强的耐性物种存活下来形成新的群落,数量增多并积累[33],来抵抗砷污染所造成的不利影响.Loren等[34]研究长期受砷和镉污染的土壤中微生物群落结构发现,土壤中细菌的群落与未污染的土壤差异明显,其中变形菌门细菌对砷和镉的耐受能力更强.Sheik等[35]研究指出,当土壤长期受到砷和铬污染后,变形菌门细菌成为优势菌,放线菌门和酸杆菌门的比例明显减少.Azarbad等[36]发现长期受锌、镉和铅污染的森林土壤中微生物的多样性并没有减少,只是改变了群落组成.变形菌门在污染土壤中占据明显优势,绿弯菌门和芽单胞菌门的丰度增加.还有一些研究[37-38]指出,变形菌门、放线菌门和厚壁菌门中的部分种属含有三价砷氧化基因(aioA和arrA)、五价砷还原基因(ACR3)和将三价砷排出体外的基因(arsB),这些基因使微生物对砷具有较高的耐性,能够在长期砷污染或者高砷污染的土壤或沉积物中形成优势微生物种群.阳宗海湖滨湿地底泥中微生物优势类群与相关研究较为一致,主要以变形菌门与绿弯菌门为主,并含有少量的放线菌门、酸杆菌门和厚壁菌门.底泥中的砷促使部分耐受菌迅速积累成为优势菌群,从而导致底泥中微生物总量有所增加.虽曾经遭受过砷污染,但经过长时间的治理和微生物自我适应使得阳宗海底泥微生物形成了稳定多样的群落.这些微生物种群能够较好地适应砷污染的环境,并在维持湖泊底泥环境生态平衡过程中起重要作用.

2.4 底泥砷形态与微生物之间的关系

基于底泥砷形态测定数据(表2)和微生物丰度数据构建冗余分析(见图5).筛选的5种砷形态在第一和第二排序轴的解释量分别为52.96%和12.99%.结果显示:阳宗海底泥中的砷形态对微生物群落的影响程度不同,对微生物类群影响最强的是无定型氧化物结合态砷(F3)且与变形菌门相关性强,其次为残渣态砷(F5)和晶型铁氧化物结合态砷(F4),非专性吸附态砷(F1)和专性吸附态砷(F2)对于微生物的影响较小.无定型氧化物结合态砷(F3)在底泥中占10.1%~25.4%,比重较大.同时,无定型氧化物结合态砷容易受环境变化的影响,进而将砷释放出来,影响底泥微生物群落稳定与微生物多样性.

图5 砷形态与微生物相关性分析

砷在底泥环境中的形态及其相互转化决定了其有效性.微生物活动在砷的迁移和形态转化的过程中起着关键的作用[40],微生物对砷的还原作用可引起砷的活化或释放[41],同时也会对砷在底泥中的结合形态产生影响,进而影响砷的生物有效性、环境行为及其在不同形态间的再分配.外源砷进入底泥后其可浸提性、生物有效性或者毒性随时间延长而逐渐降低[23].同时,砷进入底泥环境后,也会与底泥微生物发生相互影响.在厌氧微生物作用下底泥中砷的形态转化及分配比例对砷的环境行为与归趋具有重要影响.Tang等[42]向4种土壤中添加外源加砷溶液并老化一段时间后,发现土壤中的砷主要以专性吸附态砷(F2)和无定型氧化物结合态砷(F3)2种结合态为主.

阳宗海湖滨湿地底泥中生物有效态砷与非生物有效态砷的比例接近1:1,同时有效态的无定型氧化物结合态砷(F3)含量较多,对湖滨湿地中的微生物类群影响最大.显示底泥中存在砷释放的环境风险.微生物群落作为湖滨湿地生态系统的重要组成部分之一,维持着水体-沉积物的生态平衡,阳宗海主要以变形菌门为主的微生物群落中,其部分种属存在着三价砷氧化基因[37],这些基因不但促使变形菌门成为优势菌门,同时也可以降低底泥中砷的毒性,维持底泥中砷形态的稳定,减少底泥砷释放的环境风险.

3 结论

3.1 阳宗海湖滨湿地底泥微生物数量众多,类群丰富.微生物OUT数为693~1473,其中南岸湖滨区域微生物丰富度最高,OUT为1286~1473,其次是东岸与北岸湖滨区域,西岸区域微生物丰富度最低.微生物丰富度与底泥中总砷、总磷含量具有一致性,含量最高的南岸湖滨区域(总砷:34.09~34.56mg/kg,总磷:933.26~988.26mg/kg),微生物丰富度最高.

3.2 阳宗海湖滨湿地底泥微生物优势类群主要为Proteobacteria(变形菌门,15.6%~59.6%)、Chloroflexi (绿弯菌门,10.1%~44.9%)及少量的Actinobacteria (放线菌门)和Acidobacteria(酸杆菌门).阳宗海湖滨湿地在长期砷污染环境下形成了稳定多样的微生物群落结构.

3.3 阳宗海湖滨湿地底泥中砷形态主要以残渣态砷(F5)和无定型氧化物结合态砷(F3)为主,其中生物有效态砷占底泥结合态砷的19.3%~58.6%,底泥砷存在环境释放风险.无定型氧化物结合态砷(F3)对底泥中微生物影响最为显著.

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Microbial community structure and diversity of arsenic-contaminated lakeshore wetland sediments

ZHAO Li-jun1, LIU Yun-gen2, WANG Yan2*, ZHAO Rong2, LI Bo1, ZHENG Yi1

(1.Wetland College, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China；2.College of Ecology and Environment, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)., 2019,39(9)：3933~3940

The purpose of the present work was to explore the microbial community structure and diversity characteristics of arsenic-contaminated lakeshore wetland in the Plateau lakes, and to explore the relationship between the content & forms of arsenic and microbial community characteristics in the sediment. This paper collected samples of lakeshore wetland sediments from the east, west, south and north lakeshore of Yangzonghai Lake in Yunnan Province, not only the characteristics of microbial richness in sediments of arsenic-contaminated lakeshore wetlands were analyzed by 16S rRNA high-throughput sequencing technique, but also the effects of arsenic forms on microbial communities were discussed. The results showed: (1) the arsenic content of the sediment has a significant effect on the microbial richness, and the microbial richness is higher with high arsenic content in the South Bank region, which the Operational Taxonomic Units is 1286~1473, In the West Bank region the microbial richness is low with low arsenic content which the Operational Taxonomic Units is 693~1339; (2) The microbial community structure of sediments in Yangzonghai Lake Lakeshore wetland is stable, the dominant populations are Proteobacteria (15.6%~59.6%), Chloroflexi (10.1%~44.9%), with few Actinobacteria and Acidobacteria; (3) The arsenic form in the sediment is mainly composed of residual arsenic (F5) and amorphous oxide-bound arsenic (F3), and F3 has the most significant effect on the microbial community. Meanwhile, the bioavailable arsenic (non-specific adsorbed arsenic + specific adsorbed arsenic + amorphous oxide bound arsenic) in the sediment accounts for 19.3%~58.6%, the risk of arsenic release is high. The research results deepened the understanding of microbial community in sediments of arsenic-contaminated plateau lakes, and provide theoretical and scientific basis for microbial treatment of lake arsenic pollution prevention.

arsenic pollution；lakeshore wetland；sediment；arsenic form；microbial community

X172,X53

A

1000-6923(2019)09-3933-08

赵立君(1992-),男,安徽铜陵人,西南林业大学硕士研究生,主要研究方向为湿地微生物.发表论文1篇.

2019-02-25

国家自然科学基金资助项目(31560147,21767027);云南省农业联合专项(2018FG001-049)项目资助

* 责任作者, 副教授, wycaf@126.com