彭小媚,陈 栋，陈善昌，林永恩

(广西壮族自治区贺州市人民医院检验科，广西贺州 542800)

宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一,是世界范围内的主要公共卫生问题[1]，严重危害妇女的生命健康。在世界范围内,宫颈癌是女性的第四大恶性肿瘤,约占影响女性的所有类型恶性肿瘤的12%[2]，全球每年新增宫颈癌人数已超50万，死亡人数亦超20万[3]，且发病年龄日益年轻化，是威胁妇女生命健康的重要因素之一。根据我国癌症统计数据显示,2015年子宫颈癌新发病例数约为9.89万例,死亡人数约300万例[4]。人乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，持续感染是女性宫颈病变的主要原因。HPV感染引起的癌症，主要是黏膜和皮肤的鳞状细胞癌(SCC)[5]。HPV是诱导宫颈上皮细胞转变为癌前病变或癌症的最重要因素，HPV感染状态是宫颈癌筛查中的关键因素。因此，HPV检测已成为一种重要的筛查工具[6]。现已发现导致人类感染的HPV有100多种型别，而不同型别的感染与宫颈疾病的发生不尽相同，根据与宫颈癌发生的相关性进行分析，国际肿瘤研究所根据其致癌性与否将HPV亚型分为高危型和低危型两类[7]。大量研究已证实，高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的重要因素[8-9]，99%的宫颈癌患者检测出HPV高危亚型感染。有效的医学干预能够降低宫颈癌的发病率，及早发现HPV感染分型对提前进行防治有重要的临床意义。研究表明HPV亚型分布与地区、环境、人群等因素相关[10]，为了解贺州地区HPV基因分型及流行分布情况，本研究采用基因芯片技术对本院就诊的16 751例妇女的宫颈脱落细胞标本进行基因分型检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年1月至2018年9月本院妇科就诊及体检健康者，年龄10～92岁，平均(38.5±10.6)岁，自愿接受生殖道HPV感染筛查的女性宫颈脱落细胞标本为16 751例，已剔除复诊病例。

1.2仪器与试剂 PCR扩增仪黑马9600购自珠海黑马医学仪器公司，分子杂交仪Combi_H12购自深圳亚能公司，热循环仪K960购自杭州晶格科学仪器有限公司。HPV基因分型检测试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司产品。该试剂医疗器械注册证书编号为:国食药监械(准)字2014第3401227号，其特异度、灵敏度分别为95.36%和96.36%，能够满足实验检测需要。

1.3实验方法

1.3.1样本的采集与保存 以专用宫颈脱落细胞采集器进行采样。医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4～5周以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗脱管盖，洗脱管中已加有专用细胞保存液，做好样本标识4 ℃保存待检，保存不超过24 h。-20 ℃保存不超过3个月，样本应避免反复冻融。

1.3.2HPV-DNA的提取 充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干。把洗脱液全部转移到1.5 mL离心管中，13 000 r/min,离心10 min,弃去上清液，保留管底的细胞沉淀。加入50 μL裂解液悬浮沉淀，沸水浴加热10 min，13 000 r/min,离心10 min，保留上清液待用。

1.3.3聚合酶链反应(PCR)扩增 取出反应液1及反应液2各1管，做好标记，低速离心数秒，然后分别加入已提取的待测样品DNA 5 μL，反应总体系为25 μL，低速离心数秒待PCR扩增。PCR按以下条件进行扩增:50 ℃ 15 min;95 ℃ 10 min;然后以94 ℃ 30 s;42 ℃ 90 s;72 ℃ 30 s，40个循环;72 ℃延伸5 min。

1.3.4杂交 取15 mL塑料离心管，放入标有患者编号的膜条，加入A液5～6 mL及所有对应的PCR产物，将盖拧紧。将离心管放入沸水浴中加热10 min，取出放入杂交箱51 ℃杂交1.5 h。

1.3.5膜条处理 洗膜取出膜条，移至装有B液的50 mL管中，于51 ℃轻摇洗涤5 min。

1.3.6显色及结果判定 按HPV基因分型检测试剂盒说明进行杂交显色，显色结果亦按说明书进行判定。膜条上探针按固定顺序排列，由蓝色斑点显现位置即可断定HPV的亚型。其中，高危型17种包括:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82;低危型6种包括:HPV6、11、42、43、81、83。PC为显色质控点。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0软件进行统计分析，计数资料以率(%)表示，进行χ2检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同年份检测情况及感染率 2012-2018年，本院HPV项目就诊及体检人数分别为812、766、853、1 943、3 972、4 470、3 935例，随着宫颈癌科普知识的宣传及妇女对自身健康体检需求增加，HPV检测人数有逐年增加趋势，但是感染率逐年减低。16 751例受检人数共检测阳性病例4 568例，HPV感染率为27.27%。见表1。

表1 2012-2018年贺州市HPV受检人数及感染率

2.2HPV感染各亚型分布状况 16 751例女性中有4 568例感染HPV，检出频数最高的型别是HPV52型，检出构成比为16.77%(1 011/6 029)，也是单一阳性率及多重阳性率最高的亚型，分别为18.62%(629/3 378)和14.41%(382/2 651)；HPV各亚型的构成比中排在前3位的是HPV52、16、58，感染率明显高于其他亚型，构成比分别为16.77%、14.21%、8.46%。见表2。

表2 4 568例感染者HPV各亚型构成情况

2.3不同年龄组HPV感染状况分析 16 751例送检者年龄为10～92岁，以25～49岁最多，共12 532例，占74.81%。在所有年龄组中<20岁年龄组感染率最高，达56.86%；其次是≥55岁年龄组，感染率为41.54%；35～39岁年龄组感染率相对较低，感染率为22.48%。<20岁年龄组HPV感染率与其他各年龄组差异均有统计学意义(P<0.01)。≥55岁年龄组与25～54岁年龄组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与<25岁年龄组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。≥55岁年龄组高危型明显高于其他年龄组30.77%，<20岁组的低危型、高低危混合型感染率均明显高于其他年龄组，分别为18.14%和22.55%。其他年龄组中感染率相对较高的有:50～54岁年龄组单纯高危型感染率为22.22%；20～24岁年龄组单纯低危型感染为9.09%；高低危混合型中也是以≥55岁年龄组较高，占7.09%。见表3。

2.4HPV单一感染和多重感染分布状况 HPV感染存在多种亚型同时感染的情况，不同年龄组均可出现HPV单一感染和多重感染情况,以单一感染病例为主，在HPV阳性病例中检出单一型感染病例3 359例,占73.53%(3 359/4 568)；二重感染为两种亚型阳性，占18.89%(863/4 568)，HPV多重感染指同时感染HPV 3种及以上亚型病例，其中三重感染占5.06%(231/4 568)，四重感染占1.58%(72/4 568)，五重及以上感染占0.94%(43/4 568)。单一型感染中35～39岁组感染率最高为82.79%(486/587)，35～39岁年龄组单一型感染率与<30岁及≥50岁年龄组差异有统计学意义(P<0.05)。与30～34岁、40～49岁年龄组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。二重感染中20～24岁组感染率最高为24.79%(90/363)，20～24岁组二重感染率与30～54岁年龄组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 不同年龄组HPV感染状况

表4 HPV 单一感染和多重感染在各年龄组的感染率

3 讨 论

本研究应用基因芯片技术对贺州地区女性的HPV感染情况进行了大规模样本的调查，实验结果显示2012-2018年检测人数及阳性人数持续增加,而感染率逐年降低。分析原因可能是患者及医生对HPV检测及防御意识增加。16 751例样本中HPV感染者4 568例，感染率为27.27%，调查结果与中国西南地区(26.2%)[11]、浙江省湖州地区(26.83%)[12]、上海地区(28.5%)[13]及山东地区(29.00%)[14]较接近，明显高于成都地区(17.60%)[15]、武汉地区(17.46%)[16]、珠海地区(21.37%)[17]，明显低于辽宁地区(45.60%)[18]、重庆地区(37.30%)[19]及广州地区(35.00%)[20]，提示HPV感染在不同地区有较大差异，亚型的分布在各地区较为一致。HPV各亚型在4 568例阳性样本中HPV52、16、58感染率明显高于其他亚型，分别为16.77%、14.21%、8.46%，说明这3种亚型是易感亚型，结果与我国其他地区报道一致[21]，也符合亚洲人群研究结果，在亚洲宫颈癌病例中，HPV58比欧洲及非洲更为常见。但与国外人群有差异，美国感染率前3位基因型为HPV16、53、52[22]，芬兰为HPV16、31、52[23]。而这3种亚型都为高危型，应该重点关注，加强防范，该研究对该地区HPV疫苗的研制重点起到了较好的提示作用。16 751例送检者年龄为10～92岁，以25～49岁最多，共12 532例，占74.81%,说明该年龄段人群对HPV筛查有较强的意识，对早发现、早治疗起到了较好的预防作用。在所有年龄组中<20岁年龄组阳性率最高，达56.86%，可以看出该年龄段人群为HPV感染的易感人群，而该年龄段人群的自我保护意识较差，对HPV筛查的认识还不到位，应加强该人群的自我保护意识，对该人群加大宣传HPV筛查重要性的力度，及时接种HPV疫苗；其次是≥55岁年龄组，感染率为41.54%，可能与该人群的免疫力下降有关;35～39岁年龄组感染率相对较低，说明该年龄段人群的自我保护意识、HPV筛查意识和免疫力较强。

HPV单一感染占73.53%，二重感染为两种亚型阳性，占18.89%，三重感染占5.06%，四重感染占1.58%，五重及以上感染占0.94%。说明HPV感染亚型以单一亚型感染为主，与国内报道的单一感染是HPV感染的主要形式一致[24-25]，单一亚型感染率最高的是35～39岁年龄组，为82.79%，与拉丁美洲、加勒比地区及非洲大多数国家报道的45岁不同[26]。有研究报道芬兰有一个<25岁的高峰[23]。二重亚型感染率最高的是20～24岁年龄组为24.79%，可能与性行为，宿主易感性和病毒特征有关。三重及四重亚型感染率最高的均是<20岁年龄组，分别为14.41%和10.17%，说明该年龄段人群易感三重和四重亚型，可能与该人群的自我保护意识较差，对HPV的认知尚浅，且发育不成熟有关。五重及以上感染率最高的是≥55岁年龄组为3.13%，可能与该年龄段人群的生理绝经期和免疫力下降有关。

调查研究结果显示，贺州地区HPV高危感染率占72.50%，低危感染占15.28%，高低危混合感染占12.22%，说明感染类型多以高危型为主。而在高危型感染人群中，又以≥55岁年龄组单纯高危型为主，占30.77%，主要与该年龄段女性处于生理绝经期和免疫力下降导致HPV持续感染或潜伏感染病毒复活有关，且大部分因为有生殖道症状而就诊。高风险HPV基因型感染是宫颈癌的重要危险因素[27]，体现出高风险HPV检测的重要性[28]，随着人口老龄化，绝经后的妇女是宫颈癌筛查策略中重点考虑的新群体。<20岁年龄组低危感染和高低危混合感染感染率最高，说明HPV感染有低龄化多亚型化倾向，此类感染人群感染率高，可能与宫颈环境未成熟，检测标本数量少，且多数患者已有相应症状有关。持续HPV高危型感染是宫颈癌发生的必要条件，HPV检查是目前预防及控制宫颈癌发生的主要手段，同时加强不同年龄段HPV疫苗接种。在美国，2015年，42%的女孩和28%的13～17岁男孩接受了所有3种疫苗剂量[29]。有调查显示，在西安市第四医院妇科门诊单纯随机抽取前来就诊的患者1 000例,采用自行设计的问卷进行调查，结果发现，西安市门诊患者对HPV及其疫苗的知晓率较低,应加强公众健康教育宣传力度,普及HPV疫苗相关知识[30]。

4 结 论

贺州市HPV感染普遍存在于不同健康状态的女性中,以单一感染高危型为主。本研究首次对贺州地区女性进行大样本回顾性分析HPV感染和基因类型分析，HPV基因分型研究对于建立宫颈癌筛查和HPV疫苗接种策略非常重要,对贺州地区的宫颈癌的防治提供了科学的理论依据。