曹 科，罗小娟△，沈 丹，姚 强，吴苏伟，杨志林，陈运生，马东礼

(深圳市儿童医院：1.检验科；2.泌尿外科，广东深圳 518038)

隐睾是睾丸未能按正常发育过程从腰部腹膜后下降至阴囊底部，包括睾丸缺如、异位和下降不全[1]，是小儿外科常见的生殖系统先天性畸形，其病因复杂，众多遗传和内分泌因素都参与了睾丸下降过程[2]。隐睾可能会引发睾丸萎缩、恶变及成年后男性不育和性功能障碍，严重影响男性生殖健康和心理健康而受到广泛关注[3-6]。抗苗勒管激素(AMH)在男性由睾丸未成熟支持细胞分泌，具有调控生殖细胞生长发育、引起苗勒管退化及诱导睾丸下降等功能[7]。AMH主要是与抗苗勒管激素Ⅱ受体(AMHRⅡ)结合发挥生物学效应[8]。本课题组前期研究表明隐睾患儿血清AMH水平显著下降，是反映隐睾患儿睾丸发育状况的一项重要指标[9]。但AMH、AMHRⅡ基因多态性是否与隐睾发病相关，不同基因型之间血清AMH、睾酮(T)水平是否存在差异，尚不明确。本研究拟通过检测隐睾患儿及健康儿童AMH和AMHRⅡ基因多态性及血清AMH、T激素水平，初步分析AMH和AMHRⅡ基因多态性与单、双侧隐睾症及血清AMH、T水平的相关性，从基因多态性层面初步探讨儿童隐睾症的发病机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年4-8月在本院泌尿外科住院隐睾患儿49例，年龄9个月至7岁9个月，所有病例经体格检查、B超及手术探查得到确诊。纳入标准：符合 2012 年我国小儿隐睾的诊断标准[1]，所有入选病例均排除了尿道下裂、两性畸形、睾丸外伤，术前均未使用激素药物治疗。所有病例均为低位型隐睾(患侧睾丸在腹股沟管内环口下侧与阴囊上侧之间)。按隐睾睾丸的类型分为单侧隐睾组和双侧隐睾组。术中发现：单侧隐睾中，29例可以一次手术固定至阴囊，1例需要分期手术，术中发现1例隐睾严重发育不良，3例为单睾症；双侧隐睾中18例可以一次手术固定至阴囊，1例需分期手术，术中发现1例单侧隐睾严重发育不良。同时选取同年龄段40例(9个月至8岁3个月)保健科体检健康男童作为对照组，纳入标准：无腹股沟斜疝、隐睾、尿道下裂、精索静脉曲张、鞘膜积液、两性畸形、睾丸外伤、性早熟等病史，无腹股沟区外伤手术史。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2试验方法

1.2.1标本采集 所有儿童清晨空腹抽取静脉血6 mL，其中乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 mL标本，分离胶促凝管4 mL标本，分离胶促凝管标本经3 000 r/min离心10 min后取上层血清，抗凝全血和血清标本置于-20 ℃冰箱保存待测，抗凝全血和血清标本均为常规项目检测后的剩余标本。

1.2.2血清AMH、T水平测定 采用上海心语生物科技有限公司生产的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测AMH、T水平，AMH试剂盒的线性范围为0.8～35 ng/mL，T试剂盒的线性范围为0.4～18 nmol/L，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3AMH和AMHRⅡ基因序列聚合酶链反应(PCR)及测序 采用Qiagen DNA Mini试剂盒提取DNA(严格按照说明书进行)，AMH和AMHRⅡ4个基因多态性位点引物由Life Technology公司合成，引物序列见表1。珠海Hema 9600基因扩增仪完成PCR扩增，PCR反应总体积25 μL，包含2 μL 2.5 mmol/L dNTP，0.25 μL 20 mmol/L正向引物，0.25 μL 20 mmol/L反向引物，0.125 μL 5 U/μL Tag聚合酶，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL DNA模板，19.375 μL灭菌蒸馏水。扩增反应程序为94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，从变性至延伸共35个热循环后，再72 ℃延伸2 min，12 ℃保存。反应完成后，取5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物的扩增情况。PCR产物送Life Technology公司进行产物纯化和测序分析。AMH采用正向测序、AMHRⅡ采用反向测序。为保证分析的准确性，每个SNP位点均分析两次，两次分析均显示相同的结果。

表1 AMH 和AMHRⅡ4个基因多态性位点引物序列

2 结 果

2.1病例组与对照组基本信息比较 49例隐睾患儿中，单侧隐睾30例(66.7%)，双侧隐睾19例(33.3%)。单侧隐睾组年龄(3.0±2.4)岁与双侧隐睾组年龄(3.3±2.4)岁比较，病例组年龄(3.1±2.4)岁与对照组年龄(3.1±2.4)岁比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2病例组和对照组血清AMH、T水平比较 单侧隐睾组AMH、T水平分别与双侧隐睾组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，而对照组AMH、T水平均高于单侧隐睾组和双侧隐睾组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3AMH和AMHRⅡ基因型分布及其等位基因频率分布 病例组和对照组AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型、等位基因频率分布差异均有统计学意义(P<0.05)；病例组和对照组AMH Ile49Ser、AMHRⅡIVS 10+77 A>G基因型、等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)；单侧隐睾组和双侧隐睾组AMH Ile49Ser、AMHRⅡIVS 10+77 A>G、AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型、等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 血清AMH、T水平比较

注：▲与双侧隐睾组比较，△单、双侧隐睾组分别与对照组比较，P<0.05

表3 AMH和AMHRⅡ基因型及其等位基因频率分布[n(%)]

续表3 AMH和AMHRⅡ基因型及其等位基因频率分布[n(%)]

表4 不同AMH Ile49Ser基因型对应血清AMH、T水平比较

续表4 不同AMH Ile49Ser基因型对应血清AMH、T水平比较

表5 不同AMHRⅡIVS10+77A>G基因型对应血清AMH、T水平比较

表6 不同AMHRⅡ IVS 5-6C>T基因型对应血清AMH、T水平比较

表7 不同AMHRⅡ482 A > G基因型对应血清AMH、T水平比较

2.4不同AMH、AMHRⅡ基因型对应血清AMH、T水平比较 单侧隐睾组内、双侧隐睾组内、病例组内、对照组内AMH、AMHRⅡ不同基因型之间血清AMH和T水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4～7。

3 讨 论

抗苗勒管激素又名苗勒抑制物(MIS)，在男性，AMH主要由未成熟睾丸支持细胞(Sertoli cell)分泌，而T主要由成熟睾丸间质细胞(Leydig cell)分泌。因此，测定血清AMH和T水平可以分别反映睾丸支持细胞和间质细胞的功能状态、发育程度。本研究结果显示，病例组血清AMH、T水平均低于对照组，说明隐睾患儿的睾丸功能受到了损害，这与GRINSPON等[10]、MATUSZCZAK等[11]的研究结果相一致。同时笔者发现，双侧隐睾组血清AMH、T水平均低于单侧隐睾组，表明双侧睾丸未降者，其睾丸受损程度大于单侧睾丸未降者，这与HAMDI等[12]研究结论一致，而与VAN BRAKEL等[13]、KOMAROWSKA等[14]的研究结果不太一致，可能与各研究所选取的研究对象数量、年龄、隐睾类型不同等因素有关。

基因组单个核苷酸A/T/C/G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组DNA序列的多样性，即单核苷酸多态性(SNP)。它是人类可遗传变异中最常见的一种，SNP分析对疾病的易感性、早期风险性评估、预防、诊断和治疗等各方面均具有重要的作用和价值。既往研究表明，AXIN1[15]、IL-27[16]、IL-21[17]、INSL3[18]、HOXA11[19]、RXFP2[18]等基因多态性与隐睾症的发病风险相关。本研究发现，AMH、AMHRⅡ基因型分布情况与KOMAROWSKA等[14]研究结果相似，说明中国人与欧洲人的频率分布相似，不存在人种差异，但与其不同的是，笔者发现并不是所有IVS 5-6 C>T纯合子和杂合突变的病例都伴随有IVS10+77A>G和482A>G纯合子和杂合突变，这可能与人种差异有关。本研究显示隐睾病例组AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型及等位基因频率分布与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G可能与隐睾发病有关。但不同基因型之间血清AMH和T水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示血清AMH和T水平并不受AMH、AMHRⅡ基因多态性影响。

本研究表明隐睾患儿血清AMH水平显著下降，但未发现AMH基因多态性与隐睾发病具有相关性。可能与其SNP位点的选择有关，在EXAC数据库中查到的AMH基因的错位突变位点有189个，分布于基因组不同区域，位于启动子区域的位点可参与AMH的转录表达，编码区的SNP可影响翻译后关键功能基团的氨基酸序列，从而影响蛋白质的功能，最终导致对病因或特定环境的反应敏感性，而内含子区域SNP可通过影响基因剪接、信使RNA降解、转录子结合、非编码区RNA序列或与其他相关的SNP位点共同作用等最终影响基因功能。本研究只选取了AMH Ile49Ser非同义SNP位点，其改变了编码的氨基酸种类，导致第49位的异亮氨酸Ile为丝氨酸Ser所取代，虽然研究结果提示AMH Ile49Ser在研究地区儿童隐睾症发病无明显作用，但仍不能排除SNP位点的局限性，且可能存在多个位点相互共同作用进而影响实验结果。隐睾是导致男性不育、睾丸肿瘤的重要因素，AMH和AMH RⅡ基因多态性是否可以作为遗传标记用于隐睾的基因诊断并预测不育症及睾丸肿瘤等，尚有待于今后扩大样本量更深一步的研究和探讨。

4 结 论

AMH、AMHRⅡ基因多态性是否与隐睾发病相关研究甚少报道，不同基因型之间血清AMH、T水平是否存在差异，尚不明确，笔者检测了隐睾患者和健康对照儿童AMH和AMHRⅡ基因多态性及血清AMH、T激素水平，发现AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G可能与隐睾发病有关。隐睾患儿血清AMH、T水平显著低于对照组，但不受AMH、AMHRⅡ基因多态性影响。