陈 晔，顾 芸，耿建祥，杨开选，路喜安，杨邦杰，武海燕，印永祥，赵 雪

(1.东南大学附属中大医院无锡分院妇产科，江苏无锡 214001；2.南京医科大学附属妇产医院病理科，江苏南京 210004；3.南京中医药大学附属南京中医院病理科/海峡两岸精准医学协会HPV感染疾病专业委员会，江苏南京 210001)

宫颈癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤，是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位常见的恶性肿瘤。超过80%宫颈癌患者发生在发展中国家，是发展中国家妇女最主要的肿瘤类型。该肿瘤有明确的病因学，即高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染所致。在全世界范围内，宫颈癌发病率有明显的地区差异性。我国宫颈癌每年新发病例约13万人，每年死亡人数约5万人。近十年来，我国宫颈癌的发病率仍居高不下，且呈现出年轻化的趋势，因此，我国宫颈癌的预防与治疗越来越受到人们的重视。宫颈癌有许多亚型，其中最主要的类型是宫颈鳞状细胞癌，简称为宫颈鳞癌，约占宫颈癌的85%[1-4]。国内文献检索未见宫颈鳞癌组织HPV分型检测的大样本研究资料。本研究旨在探讨以江苏省为主的区域性宫颈鳞癌组织中HPV感染基因型分布状况及疫苗保护的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集1978年11月至2018年9月江苏省无锡市锡山人民医院、安徽省安庆市第一人民医院和第二人民医院、安徽省当涂县人民医院、浙江省宁波市鄞州人民医院、山东省临沂市肿瘤医院、河南省商城县人民医院、江苏省南京市妇幼保健院、南京市六合区人民医院和六合区中医院、南京市大厂医院、南京市中医院、上海梅山医院、镇江市第一人民医院、镇江市丹徒区人民医院、杨中市人民医院、徐州市中医院、徐州市妇幼保健院、新沂市人民医院、邳州市人民医院、射阳县人民医院、大丰市人民医院、常熟市第一人民医院、常熟市中医院、金湖县人民医院、靖江市人民医院、盐城市第一人民医院、兴化市人民医院、昆山市第一人民医院、扬州市洪泉医院、江苏大学附属医院病理科病理组织学诊断为宫颈鳞癌的患者1 021例，患者年龄21～90岁，平均(53.5±7.7)岁。本研究经过南京中医院伦理委员会批准(批准号：2012NJL008)。由一位病理科副主任医师和一位主治医师根据WHO(2003年)妇科肿瘤组织学的分类标准进行复片，并复习其临床病理资料。

1.2仪器与试剂 PCR仪为美国Life Technology公司生产的ABI7500型，高速冷冻离心机为德国eppendorf公司生产的5810 R型，分子杂交仪为江苏省兴化市分析仪器厂生产的FYY-3型，-20 ℃冰箱由青岛海尔有限公司生产。HPV基因分型检测试剂盒,由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。显色液需新鲜配制，使用时所需浓度加蒸馏水配制。

1.3方法

1.3.1标本的采集 先去除每例石蜡组织周边多余的石蜡，将其石蜡组织切成4 μm厚的切片，切3～5片石蜡组织即可。用专用的镊子轻轻夹取，放入小离心管中，切第2例石蜡组织前，用次氯酸钠溶液擦刀片及镊子各3次。

1.3.2DNA的提取 将切下的石蜡组织片放入1.5 mL离心管中，加入裂解液150 μL，充分振荡混匀，放入金属浴中加热100 ℃ 10 min，立刻13 000 r/min离心10 min，离心半径7 cm。取中间层DNA溶液待用。PCR扩增、杂交、孵育和显色按说明书进行规范操作。每份标本显色后，根据膜芯片上的各个型别位点杂交信号的有无，来判断结果。低危型：6、11、42、43、81、83型，其他型别均为高危型。

1.4统计学处理 应用统计软件包 SPSS19.0对相关数据进行统计学分析，计数资料以率表示，单一型别检出率与多种型别检出率及九价疫苗的保护谱与二价疫苗的保护谱两者之间的比较采用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1宫颈鳞癌组织中HPV感染基因型分布状况 1 021例宫颈鳞癌组织中检出HPV阳性者937例，总检出率为91.77%(937/1 021)，单一型别感染者770例，单一型别检出率为75.42%(770/1 021)，多种型别感染者167例(其中2型感染者130例，3型感染者29例，4、5、6型感染者各2例，7、9型感染者各1例)，多种型别检出率为16.36%(167/1 021)。937例HPV阳性者中，检出不同型别HPV检出频率数合计1 163次，其中低危型HPV检出频率数合计53次，高危型HPV检出频率数合计1 110次。单一型别感染者中高危型HPV前8位依次是16型为69.74%(537/770)、18型为6.88%(53/770)、58型为5.97%(46/770)、52型为3.77%(29/770)、31型为3.64%(28/770)、33型为3.25%(25/770)、59型为2.34%(18/770)、45型为1.17%(9/770)；多种型别感染者中HPV前8位依次是16+18型为19.16%(32/167)、16+58型为6.59%(11/167)、16+52型为5.99%(10/167)、16+33型为5.39%(9/167)、11+16型为2.99%(5/167)、16+31型为2.99%(5/167)、16+45型为2.99%(5/167)、16+42型为2.40%(4/167)、16+59型为2.40%(4/167)。宫颈鳞癌组织高危型HPV前8位检出频率的依次分别是16型为57.52%、18型为9.29%、58型为6.88%、52型为4.64%、33型为3.96%、31型为3.78%、59型为2.75%、45型为1.72%，其他HPV型别的检出频率为9.46%。HPV各单一型别检出率及各型别检出频率见表1。

2.2宫颈鳞癌组织中单一型别与多种型别HPV检出率及九价和二价HPV疫苗保护谱的比较 1 021例宫颈鳞癌组织中HPV阳性者为937例，其中单一型别HPV检出者770例，多种型别HPV检出者167例，单一型别与多种型别HPV检出率比较，差异有统计学意义(75.42%vs. 16.36%,P<0.05)；对770例单一型别与167例多种型别HPV感染者，九价HPV疫苗(6、11、16、18、31、33、45、52和58型)的保护谱与二价HPV疫苗(16和18型)的保护谱比较，差异有统计学意义(90.82%vs.68.52%，P<0.05)。

表1 宫颈鳞癌组织中HPV单一型别型检出率和各型别检出频率

3 讨 论

在世界范围内，导致宫颈鳞癌的高危HPV型别、分布比例及致癌风险度的判断都是以宫颈鳞癌组织标本检出的结果作为标准的。低危型HPV(6、11、42、43、81、83型等)极少出现于宫颈鳞癌组织中，高危型HPV，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型等与宫颈鳞癌发生密切相关，其中HPV16和18型是宫颈鳞癌组织中最常见的型别，其致癌风险位居前两位[1，5]。宫颈鳞癌组织中高危型HPV16和18型感染在全球很普遍，各国之间没有明显的地区和种族差异性，分别占高危HPV检出率的前两位，只是检出率有差异，而其他一些HPV型别确存在着地理位置和种族上的差异性[5-6]。由于高危HPV各型别致宫颈鳞癌风险度存在着差异性，弄清楚各主要致癌的高危HPV型别的分布状况意义重大。因此，WHO建议各国都应建立起本国的宫颈鳞癌组织的HPV分型数据库，这将对各国宫颈鳞癌的防治及宫颈鳞癌HPV预防性疫苗的研制都具有重要指导意义。

3.1宫颈鳞癌组织中HPV检出率、各型别检出频率分布状况 一项38个国家收集了8 977例宫颈癌石蜡组织标本大样本研究提示HPV检出率为85%，其中检出最常见的HPV是16、18、31、33、35、45、52、58型，这8种HPV型别占总检出率的91%[5]。本研究1 021例宫颈鳞癌组织中总的HPV检出率为91.77%，其中单一型别检出率为75.42%，多种型别检出率为16.36%，宫颈鳞癌组织中高危型HPV前8位检出频率依次分别是16型为57.52%、18型为9.29%、58型为6.88%、52型为4.64%、33型为3.96%、31型为3.78%、59型为2.75%、45型为1.72%，这8种HPV型别占总检出频率的90.54%。本研究宫颈鳞癌组织中总的HPV检出率高于上述宫颈癌组织大样本研究，而8种HPV型别检出频率与上述大样本研究总检出率非常接近，型别略有不同，大样本中出现了35型，本研究中出现了59型。这可能与两组研究使用的HPV检测方法不同，或收集的标本种类和数量以及地域和种族的不同有关。

本研究宫颈鳞癌组织中高危型HPV前8位单一型别检出率和各型别检出频率排序比较，除31型和33型在两者间位置互换外，其他型别排序相同，多种型别HPV的检出率和检出频率排序比较，只是45型多种型别略高于59型多种型别，其他型别排序相同。由于高危型HPV在引起宫颈癌时，各种型别的致癌风险度存在着显著的差异性，其在全球范围内各国各地区常见的致癌型高危HPV型别也存在着差异性[5，7-9]。因此，弄清楚各国各地区宫颈癌组织中常见的高危型HPV感染分布比，有利于临床妇科医师对宫颈上皮内瘤变行HPV感染型别致癌风险度的评估和判断，以便尽早阻断此病变的进展，也有利于各国研制适合本国国情的宫颈鳞癌HPV感染谱的多价HPV预防性疫苗。

3.2宫颈鳞癌组织中高危型HPV感染型别分布与宫颈鳞癌的预防 检测宫颈鳞癌组织中高危HPV感染型别分布的意义在于它提供了各国或各个地区导致宫颈鳞癌的各主要高危HPV型别、比例以及各高危型别致癌的风险度。宫颈鳞癌都有一个从正常宫颈组织到宫颈上皮内瘤变,再到宫颈浸润性鳞癌的连续发展的过程。高危型HPV持续感染是宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤变的重要致病原因，其与宫颈鳞癌的发生、发展有着密切的关系。因此，正确判断宫颈上皮内瘤变病变的进展风险，寻找宫颈上皮内瘤变进展的影响因子，构建宫颈上皮内瘤变致癌进展的预警模式已日益受到临床妇科医师的关注。

依据循证医学原则，弄清我国区域性宫颈鳞癌组织中高危HPV感染型别分布有利于临床妇科医师对宫颈上皮内瘤变的逆转或进展做出预判和评估。因此，临床上高危HPV分型检测和宫颈上皮内瘤变的进展预警受到了前所未有的重视。一项关于预防浸润性宫颈癌的大样本随机对照试验发现，高危HPV单项筛查效果比细胞学单项检查效果高60%～70%，该研究支持对年龄大于30岁女性开展时间间隔不少于5年的高危HPV筛查[10]。研究发现大多数宫颈上皮内瘤变(95.90%)复发病例与特定型别的高危HPV持续感染有关，其中74.50%是高危HPV16和18型持续感染，高危HPV31和33型在宫颈上皮内瘤变Ⅱ+复发患者中的感染率较低。高危HPV16和18型持续感染较其他高危HPV感染者，两次宫颈锥切间隔时间要短，预示着更早更容易复发[11]。一项Meta分析发现虽然宫颈上皮内瘤变Ⅱ+治疗后高危HPV16型阳性者疾病复发风险最高，HPV16型感染所致的宫颈上皮内瘤变Ⅱ+不太可能自然消退，一旦确诊应及时治疗，但其他非常见型别高危HPV阳性(不是HPV16、18、31、33和45型)患者宫颈上皮内瘤变Ⅱ+的累积复发率也高达30%，故临床上非常见型别高危HPV的持续感染也不可忽视[12]。

与本研究宫颈鳞癌组织中高危HPV16和18型风险度排序前两位(两者检出频率为66.81%)，而高危HPV33和31型排在第5和第6位(两者检出频率为7.74%)风险度偏低的状况相吻合。在我国要重视区域性排名第3和第4位的高危HPV58和52型(两者检出频率为11.52%)，兼顾高危HPV59和45型(检出频率分别为2.75%和1.72%)。因此，临床上对女性行宫颈高危HPV分型检测，是30岁以上的女性感染风险度高的高危HPV感染者，是否行阴道镜检查及是否给予密切随访的一项重要的参考指标。

3．3宫颈鳞癌HPV各型别分布与HPV预防性疫苗保护谱的关系 对全球各国宫颈癌组织标本研究发现，高危HPV16型和18型感染率最高，在检出的所有高危HPV型别中，HPV16型检出率占50%，HPV18型检出率占14%，HPV45型检出率占8%，HPV31型检出率占5%，其他HPV型别检出率占23%。我国宫颈癌组织HPV感染型别中，52和58型检出率较高。HPV45型在非洲西部宫颈癌组织中很常见，而HPV39型和59型仅在美洲中部和南部宫颈癌组织中出现较多[5，13-14]。本研究以江苏省为主的区域性宫颈鳞癌组织中HPV感染基因型检出频率依次是是16型为57.52%、18型为9.29%、58型为6.88%、52型为4.64%、33型为3.96%、31型为3.78%、59型为2.75%、45型为1.72%，其他HPV型别的检出频率仅为9.46%。与上述全球各国宫颈癌组织各型别HPV感染所占比比较，除16和18型排序相同外，其他各型别均有不同，且型别所占的比例也有不同，国外45型排序第3位，所占比例也比较高，本研究45型排序靠后(第8位)，所占比例也比较低。58和52型是本文宫颈癌组织中次重要的两个型别(两者检出频率为11.52%)，本研究中59型比45型常见，检出频率比45型高1.03%，如果我国研制九价HPV预防性疫苗应该将59型纳入其中，而不是45型。接种HPV预防性疫苗是宫颈癌的一级预防策略，二价预防性HPV疫苗对本研究宫颈鳞癌的患者的保护谱为68.52%(642/937)，九价预防性HPV疫苗对宫颈鳞癌的患者的保护谱为90.82%(851/937)，两种预防性HPV疫苗保护谱比较，差异有统计学意义(P<0.05)。建议女性如果接种HPV预防性疫苗的话，最好选择接种九价疫苗，实现一次接种，可获得最大化的疫苗保护谱。

综上所述，宫颈癌致癌HPV型别风险度的确定是以宫颈癌组织标本检出的结果作为金标准的。本研究宫颈鳞癌组织中HPV感染检出频率前8位排序依次是16、18、58、52、33、31、59和45型。在全球范围内，高危HPV16和18型是致宫颈鳞癌风险度最高的两种型别，且排序相同，由于HPV感染存在着地域和种族上的差异性，其他致癌HPV型别的排序不尽相同，且各型别检出频率也存在着差异，因此，世界各国都应建立本国的宫颈鳞癌组织HPV感染分型大数据库[15-17]。2006年起西方国家先后批准接种二价、四价(6、11、16和18型)和九价HPV预防性疫苗，十年后，我国于2016年先后批准上市了二价、四价和九价(有条件上市)预防性HPV疫苗，这些预防性疫苗都是国外公司在我国上市的产品。我国女性如接种HPV预防性疫苗的话，建议选择接种九价疫苗，一次接种，可获得最大化的保护谱。目前，我国尚没有宫颈鳞癌组织的大样本HPV感染分型数据库，无论HPV检测试剂的研发，还是HPV预防性疫苗的研制都是依据国外的资料。因此，尽快建立起我国自己的宫颈鳞癌组织HPV感染分型数据库是非常必要的，这有利于临床妇科医师对宫颈上皮内瘤变的发展趋势作出评估和预判，以便适时对患者行干预治疗，也有利于我国宫颈鳞癌防治以及HPV试剂和HPV预防性疫苗的研制。

4 结 论

对女性宫颈鳞癌组织大标本行HPV分型检测，有利于妇科医师对宫颈上皮内瘤变HPV感染型别致癌风险度的判断及防治，也有利于对感染了高致癌性HPV女性的随访工作及HPV疫苗的保护谱的评估。