邢超 高常青 雷苑 孙兴怀

(1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031；2.中南大学湘雅三医院实验动物中心 长沙 410013)

青光眼是仅次于白内障的全球第二大致盲性眼病，衰老是青光眼的“强烈高危诱因” (strong risk factor)[1-2]。随着全球人口老龄化，预计到2020年全球青光眼患者将达8 000万[3]，其中约有800万的患者将会失明。我国50岁以上人群原发性青光眼患病率为2.1%，致盲率高达10%。增高的眼压通过机械压迫和引起视神经缺血2种机制导致视神经损害。降眼压是目前临床治疗青光眼最有效的方法。临床使用的降眼压药物是通过3种机制实现眼压下降的，包括促进经典或非经典通路房水引流(如毛果芸香碱、ROCK抑制剂和拉坦前列素等)，减少房水分泌(如β受体阻滞剂等)。目前降眼压效果最好的前列素衍生物类药物主要是通过增加非经典通路，即葡萄膜/巩膜途径的房水外流来降眼压的，但是通过该通路的房水仅占房水总外流量的4%～17%[4]。 绝大部分(83%～96%[5]) 的房水则是由经典房水外流通路 —— 经小梁组织和Schlemm管(SC)流出眼球进入体循环。

DBA/2J小鼠作为一种重要的青光眼动物模型，用于研究高眼压相关的进行性视网膜神经节细胞(retinal ganglial cell，RGC)减少、视神经变性和青光眼视功能障碍[6-8]。虹膜基质萎缩是由于酪氨酸相关蛋白1b突变(Tyrp1b)造成的，虹膜色素分散是由编码跨膜糖蛋白基因GpnmbR150X的未成熟停止密码子突变引起的[6,9]。DBA/2J小鼠在3～4月龄时，会出现边缘虹膜缺损，瞳孔边缘色素分散和虹膜增厚[6]。分散的色素可进入前房，并逐渐在小梁网中聚积，从而阻碍了房水的流动，导致眼压升高。在6～9月龄眼压达到最高值[6-7]。10～12月龄小鼠出现RGC损失和视觉功能障碍，最终失明[6]。

然而，作为重要青光眼模型的DBA/2J小鼠，其房水动力学基本参数尚不明确，常用青光眼药物对其降眼压的效果亦罕见报道。因此，本研究拟测量DBA/2J小鼠的经典通路房水外流系数，以及选择常用青光眼药物拉坦前列素(通过非经典路径促进房水外流)和毛果芸香碱(通过经典路径促进房水外流)在其不同月龄段的降眼压效果，来评价不同降眼压药物实验研究的适当动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物 本实验采用3月龄及10月龄的C57BL/6小鼠和DBA/2J小鼠，分别用0.5%毛果芸香碱或0.005%拉坦前列素2种药物滴右眼(干预眼)，左眼滴磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(对照眼)，给药2周。共8个实验组，8只/组，共128眼。C57BL/6小鼠作为本研究的对照品系，由于其品系稳定且易于繁殖，广泛用于青光眼等疾病模型的建立[10-11]及其药物机制[12]的研究。所有动物实验规范都依照ARVO的声明进行。小鼠饲养在白色塑料笼盒里，在12 h/12 h的明暗交替的环境中使用标准的小鼠粮饲喂。DBA/2J小鼠最初是从杰克逊实验室购得，C57BL/6小鼠从上海南方模式生物研究中心购得。

1.2 药品 本研究使用2种降低眼压的药物，分别为毛果芸香碱 (硝酸毛果芸香碱滴眼液，5 mL∶25 mg，山东博士伦福瑞达制药有限公司) 和拉坦前列素(拉坦前列素滴眼液, 25 mL∶125 μg，辉瑞制药，比利时)。毛果芸香碱每天眼表给药2次(分别在上午9时和下午5时)，每次1滴；拉坦前列素每天眼表给药1次(上午9时)，每次1滴。将药物滴于右眼共2周；左眼作为自身对照，给予PBS同样滴药。

1.3 眼压测量 实验对3、10月龄的小鼠双眼眼压进行测量。用动物专用眼压计 (Tonolab，Icare)测量眼压，每只眼重复测量2次，最终眼压取2次平均值。

1.4 房水动力学测量 鼠眼按既定的方法灌注[13]。实验研究小鼠的眼睛在处死后10 min内摘除并保存在DMEM培养基中直到灌注。 首先将摘除的眼球固定在支架上，用33 G斜尖纳米针套管针安装在一个连有玻璃注射器(50 μL, Hamilton, UK)的泵上进行小鼠眼前房灌注。运用电脑控制注射器泵，将可变流量(Q)输送到前房，以维持所需的眼压(压力传感器Honey well, model 142PC1G)。在恒定压力(P)为8、15、22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的条件下，用PBS(Invitrogen, UK)对眼球进行灌注，每个压力水平至少灌注20 min。由于是对摘除的眼球进行灌注，为获得相应的体内眼压，需在灌注压力中加上巩膜外静脉压力，如8 mmHg灌注压大约相当于13～18 mmHg体内压[14-16]。软件以10 Hz的频率测量流量和压力，每10 s电子记录1次。房水流畅系数(C) =流量(Q) /压力(P)。假设在平衡状态下，总流入量等于总流出量，眼球的巩膜压力等于0。通过对3种不同压力 (8、15、22 mmHg)的流量与压力之间的关系进行线性回归分析，计算出经典通路房水流畅系数。

1.5 前房角组织形态 选择在恒压(8 mmHg)时，注入4%多聚甲醛固定眼球，并保存在4%多聚甲醛中(1～3个月)，然后处理石蜡嵌入，切片(7 μm)，苏木素-伊红(HE)染色。切片用标准光学显微镜观察 (Leica, 美国)。

1.6 统计学处理 使用Mann-WitneyUtest (SPSS 16, Chicago)分析数据。当P<0.05，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药理学实验

2.1.1 毛果芸香碱 对于3月龄小鼠，C57BL/6小鼠使用毛果芸香碱后眼压比对照眼显著降低了2.0 mmHg(n=8，P<0.05)；而DBA/2J小鼠眼压降低了2.6 mmHg (n=8，P<0.05，图1A)。对于10月龄小鼠，C57BL/6小鼠使用毛果芸香碱后眼压显著下降了3.0 mmHg(n=8，P<0.05)，DBA/2J小鼠眼压未显著下降(降幅仅为1.3 mmHg ，n=8，P>0.05，图1B)。

2.1.2 拉坦前列素 对于3月龄C57BL/6小鼠，使用拉坦前列素后眼压显著下降(n=8，P<0.05，图1C，图2)。对于10月龄小鼠，虽然拉坦前列素仍显著降低了DBA/2J小鼠的眼压, 但是眼压降幅从3月龄时的29.1%下降到15.6%(n=8，P<0.05，图1D)。

图1. 3月龄、10月龄DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠用药前后眼压变化

在使用毛果芸香碱后，3月龄DBA/2J和C57BL/6小鼠眼压降幅较为相似(分别为13.8%和16.5%)，而10月龄DBA/2J小鼠眼压下降幅度仅为同月龄C57BL/6小鼠的32%。使用拉坦前列素后，3月龄DBA/2J小鼠眼压降幅是C57BL/6小鼠的74%，10月龄小鼠其眼压降幅百分比缩小到68%(图2)。

药理学实验研究了2种青光眼药物(毛果芸香碱和拉坦前列素)对3月龄、10月龄的DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠的降眼压效果，实验发现拉坦前列素的降眼压效果有年龄依赖性。

2.2 基础房水动力学参数 10月龄、12月龄的DBA/2J小鼠的眼压分别为(17.3±2.4)mmHg、(17.7±2.1)mmHg，显著高于同月龄C57BL/6小鼠的眼压(11.3±1.1)mmHg和(13.2±1.3)mmHg(图3A)。本实验仅选用3月龄和10月龄小鼠进行研究。DBA/2J小鼠的房水流出系数为0.004 1 μL·min-1·mmHg-1，显著低于正常C57BL/6小鼠的房水流出系数0.006 8 μL·min-1·mmHg-1(图3B)。10月龄DBA/2J小鼠与10月龄正常C57BL/6小鼠前房角形态见图4。对比发现DBA/2J小鼠虹膜分散的色素附着于其小梁网上。

图2. 对比3月及10月龄2种小鼠在2种药物作用下眼压下降百分比

图3. 正常DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠眼压(A)、房水动力学(B)参数变化

图4. 10月龄正常C57BL/6(A)小鼠和DBA/2J(B)小鼠前房角形态。光镜下前房角组织形态对比，HE染色 ×200

3 讨论

DBA/2J小鼠携带2种自发的基因突变，可发展成虹膜基质萎缩和虹膜色素分散。其视网膜和视神经退化症状与人类的慢性青光眼相似[17]。本研究报道了DBA/2J小鼠作为研究青光眼发病机制与治疗策略研发的重要模型，其房水动力学特征及对2种临床常用降眼压药物(拉坦前列和毛果芸香碱)的反应。

在DBA/2J小鼠上，毛果芸香碱的降眼压作用与小鼠年龄高度相关。对于3月龄小鼠，毛果芸香碱能显著降低DBA/2J 与C57BL/6小鼠的眼压。而对于10月龄的DBA/2J小鼠，拉坦前列素仍可以显著降低其眼压，但毛果芸香碱失去了降眼压作用。

毛果芸香碱在DBA/2J小鼠上所呈现的年龄相关性可能与该小鼠的特性及2种药物的作用机制有关。毛果芸香碱是一种具有直接作用的拟胆碱药物，可直接刺激位于瞳孔括约肌、睫状体及分泌腺上的毒蕈碱受体，通过收缩瞳孔括约肌，使其周边虹膜离开房角前壁，开放房角，增加房水排出。同时还通过收缩睫状肌的纵行纤维，增加巩膜突的张力，使小梁网间隙开放，房水引流阻力减小，增加房水排出，从而降低眼压。3月龄的DBA/2J小鼠，其虹膜弹性较好，纹理清，无色素脱失、无萎缩，毛果芸香碱能够通过其作用机制降低眼压。而对于10月龄的DBA/2J小鼠，其虹膜老化，色素分散、脱失，阻塞小梁网。这可能是导致毛果芸香碱降眼压作用失效的原因。

拉坦前列素是前列腺素F2α(PGF2α)的类似物,对前列腺素类受体具有高度选择性,通过增加葡萄膜巩膜的房水外流而降低眼压。也有文献[18]报道拉坦前列素也可通过经典通路降低眼压，通过光学相干层析成像测量人眼Schlemm管内径，用药后内径显著扩大。虽然10月龄的小鼠虹膜老化，色素分散，阻塞小梁网，但是拉坦前列素仍能通过上述途径降低眼压。所以，虽然其降眼压效果较3月龄DBA/2J小鼠有所下降，但仍有显著降眼压效果。

有文献[19]报道，在单次局部使用拉坦前列素后，眼压在8～12 h下降到最大，24 h内眼压低于预处理水平。本研究眼压的测量在该药物的起效时段内，未发现延迟效应，且该药物在DBA/2J小鼠上的作用效果与临床上观察到的色素性青光眼作用效果一致[20-21]。

综上所述，DBA/2J小鼠作为青光眼模型，由于其虹膜色素分散、脱离等特点，并非适合所有降眼压药物的筛选，特别是通过经典通路降眼压的药物。