孙留霞,袁文菊,侯喜林

(1.周口职业技术学院农牧工程学院,河南 周口 466001;2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江 大庆 163319)

牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCV)是引起新生犊牛腹泻和成年牛呼吸道疾病最主要的病原[1-2],目前还没有特效的药物治疗BCV,接种疫苗是预防BCV有效途径之一[3]。目前国内外学者多数集中研究灭活疫苗,并注重超前免疫[3-4]。2002年,Keico[5]制备油乳剂灭活疫苗接种怀孕母牛,并进行了田间试验,使免疫母牛产生了较高的抗体水平,能有效预防BCV感染。本试验通过评价制备的BCV灭活疫苗的免疫效力,旨在为BCV疫苗的研制及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞 BCV-YC分离株、人直肠癌细胞(HRT-18)均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院馈赠。

1.2 实验动物 8周龄雌性小鼠,购自河南省实验动物中心;产前两个月龄健康妊娠母牛及六月龄健康育成牛,由周口市顺达奶牛繁育中心提供。

1.3 疫苗制备 BCV-YC分离株在人直肠癌细胞(HRT-18)上培养增殖,收获的病毒培养物反复冻融后(12 000 r/min离心10 min),收集上清病毒液,然后测定病毒感染力滴度为106.59TCID50/mL[6]。获得的病毒液中加入甲醛溶液,使甲醛终浓度为0.05%(v/v),置于37℃摇床上灭活48 h。接种人直肠癌细胞(HRT-18)检测灭活效果,然后按常规方法制备油乳剂疫苗[7],于4℃保存备用。

1.4 疫苗检验

1.4.1 物理性状及无菌检验 按文献[7]所列的方法进行外观检查、稳定性检测、剂型检测及黏度检查。另将制备的油乳剂灭活疫苗分别接种于马丁肉汤、厌氧肉肝汤和麦康凯琼脂培养基上,37℃培养48～72 h,做无菌检验[8]。

1.4.2 安全检验 (1)灭活效果检查：取灭活后的病毒液,按100个TCID50/mL接种已生成良好HRT-18的细胞,72h内观察有无细胞病变。将细胞液传代培养1次,72 h内观察有无细胞病变,若仍不出现细胞病变,认为灭活完全。

(2)小鼠反应：取5只8周龄健康小鼠,皮下接种2 mL/只疫苗,同时设盐水对照,观察14 d,检查接种局部和小鼠全身的反应。

1.5 小鼠免疫效力检验 检验合格的疫苗按以下方案接种8周龄健康小鼠,用间接ELISA抗体检测方法进行疫苗效力检验。

1.5.1 不同佐剂的免疫效力比较 将24只8周龄雌性小鼠平均分为4组,分别免疫油乳佐剂疫苗、铝佐剂疫苗、不加佐剂疫苗和生理盐水。皮下多点注射0.3 mL/只,免2次,间隔期为3周。免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,小鼠断尾取血,分离血清,间接ELISA检测。

1.5.2 不同剂量的免疫效力比较 将40只8周龄雌性小鼠平均分为4组,其中3组分别按0.1 mL、0.3 mL、1 mL不同剂量进行腹腔接种小鼠,另外1组为空白对照组,共免两次。免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,小鼠断尾取血,分离血清,间接 ELISA检测。

1.5.3 不同免疫途径的免疫效力比较 将18只8周龄雌性小鼠平均为3组,分别以最佳剂量按腹腔注射、皮下多点注射、大腿肌肉注射进行两次免疫。免后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,小鼠断尾取血,分离血清,间接ELISA检测。

1.5.4 攻毒试验 攻毒前观察疫苗免疫组和对照组小鼠的精神状态以确定动物的健康状况。二免后第10天,免疫组和对照组腹腔注射最小致死量2倍量的病毒液。攻毒后,每天观察小鼠的精神状态、发病情况3次。综合分析攻毒组及对照组小鼠的的精神状态、死亡数。求出疫苗的保护率=存活数/攻毒数×100%。

1.6 牛体免疫效力试验

地桃花提取物室内抑制活性筛选结果显示，地桃花提取物对10种供试植物的根、茎抑制效果不一致，高浓度比低浓度地桃花提取物对供试植物的抑制效果更强(表1)。在10 mg/mL地桃花提取物处理下，地桃花提取物对刺苋、稗的抑制效果最好，根长抑制率分别为74.42%、80.24%，茎长抑制率分别为93.63%、72.07%；对高粱、藜、水稗和千金子也有一定的根长抑制作用，抑制率介于50%～71%之间；而对香附子的根长抑制效果最差，根长抑制率仅为22.38%。

1.6.1 免疫抗体检测 建立好的间接ELISA抗体检测方法[9]和中和试验方法检测牛只免疫抗体水平。

1.6.2 最小免疫剂量的确定 选择6月龄健康育成牛8头随机分为4组。分别颈部肌肉注射2 mL、5 mL、10 mL BCV油乳剂灭活疫苗,对照组注射不含抗原的白油。首免后21 d后以同等剂量进行加强免疫。免疫后连续两周每日观察牛只注射部位局部反应及有无全身症状。于免疫前和免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、60 d、72 d、90 d、120 d 采集血样分离血清-20℃保存备用。

1.6.3 妊娠母牛免疫效力试验 把同期发情配种的荷斯坦孕牛12头随机分为3组,分别为颈部肌肉注射组、皮下注射组和对照组。免疫组牛在产前2月和1月分两次免疫BCV灭活疫苗(5 mL/头),对照组注射不含抗原的白油。分别于免疫前和免疫后 7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、60 d、72 d、90 d、120 d采集血样分离血清-20℃保存。待母牛产犊后,立即哺犊牛以初乳,出生后8～10 h,用分离的牛冠状病毒(YC株)攻毒,剂量为每头口服2 mL 106.25TCID50/mL,记录犊牛腹泻表现及死亡情况,用已建立的RT-PCR方法[10]检测粪便中的BCV。

2 结果

2.1 疫苗形状及无菌检验 疫苗外观呈白色均质乳剂,滴于蒸馏水中呈圆的油滴状不分散。疫苗经3 000 r/min离心15 min后,无分层和破乳现象。以出口内径为1.2 mm的1 mL吸管吸取疫苗1 mL,疫苗垂直流出0.4 mL的时间为(5±0.5)s。疫苗经3种培养基培养,均无细菌生长。

2.2 安全性检验

2.2.1 灭活效果检验 经灭活检验表明,细胞没有出现病变,灭活完全。

2.2.2 小鼠反应 用2 mL油乳剂灭活苗对小鼠进行鼠急性腹腔下毒性试验,2周内3只小鼠均未出现严重的临床症状或死亡,说明该疫苗安全可靠。

2.2.3 牛体反应 试验牛在15 d观察期内,未见体温升高等不良反应,注射部位吸收良好,说明30 mL及其以下注射剂量是安全的。

2.3 小鼠免疫效力检验 通过对小鼠不同佐剂、不同免疫途径和不同免疫剂量的免疫效力比较,可以看出免疫组小鼠在2次免疫后,均产生了高水平特异性抗体,油乳佐剂疫苗组和铝佐剂疫苗组抗体水平差异不显著(P＞0.05),油乳佐剂疫苗组和铝佐剂疫苗组与无佐剂疫苗组抗体水平差异均为极显著(P＜0.01),不同免疫途径之间抗体水平差异不显著。不同免疫剂量对抗体水平有着一定的影响,1 mL免疫组与0.3 mL组抗体水平差异不显著(P＞0.05),但是这两个剂量组与0.1 mL剂量组抗体水平差异均为极显著(P＜0.01)(见图1、2、3)。从攻毒保护性试验结果(见表1)计算出的保护率可以得出同样的结论。

图2 不同免疫途径效果比较结果

2.4 疫苗免疫试验结果

图3 不同免疫剂量效果比较结果

表1 不同剂量攻毒试验结果

2.4.1 最小免疫剂量的选择 利用建立好的ELISA方法和中和试验方法对每组免疫牛血清抗体水平分别进行检测,可见免疫剂量为2 mL/头时,在免疫后第14天可产生一定的抗体;第42天达到峰值,但该峰值较低不足以产生有效的保护力;免疫剂量为5 mL/头时,在免疫后第7天就可产生一定的抗体;在免疫后第14天产生的抗体可己达到有效保护,中和抗体第28天达到高峰,ELISA检测产生的抗体OD值第42天达到高峰,可以产生有效的保护力;而免疫剂量为10 mL/头试验组,虽然高于5 mL/头组,但是差别不明显。因而选择疫苗的最小免疫剂量为5 mL/头。

2.4.2 妊娠母牛免疫效力试验

2.4.2.1 ELISA检测抗体结果 利用建立的ELISA抗体检测方法对每组免疫妊娠母牛血清抗体水平分别进行检测,记录数据见表2,两种免疫途径在第14天时就可以检测到抗体,平均OD值分别为0.64±0.019、0.52±0.019均可以判定为阳性,在第42天时抗体达到最大值,随后抗体缓慢下降,第120天仍能检测到较高的抗体水平。

表2 免疫后的ELISA抗体检测OD值平均水平

2.4.2.2 中和抗体的检测结果 利用血清中和试验对免疫后不同天数的妊娠母牛采血进行中和抗体的检测,见表3。免疫后7 d中和抗体效价分别为1∶3.6 和 1∶2.0,小于 1∶4,判为阴性,第 14 天时为1∶8判为阳性。颈部肌肉注射组在42 d时达到高峰中和效价为1∶128,而皮下注射组在42 d时最大值为1∶64,此后中和抗体水平均呈下降趋势,但是到第120天时仍达1∶32以上。

表3 免疫后诱导的中和抗体平均水平

2.4.2.3 攻毒试验 结果发现,饲喂初乳的免疫组没有发生腹泻,对照组犊牛则不同程度腹泻,攻毒后2 d后从对照组犊牛排泄物中利用建立的RTPCR检测方法检测到阳性BCV。

3 讨论

3.1 我们从猪冠状病毒疫苗、犬冠状病毒疫苗等其他动物冠状病毒疫苗的研究中发现,油乳剂灭活疫苗可以有效防治动物冠状病毒感染。国内学者谢敏康编译的文章中报道,俄罗斯学者研制出防制新生犊牛腹泻的四联灭活苗[11]以及日本Keico[5]研究抗牛冠状病毒感染的油佐剂疫苗均可以安全有效防制牛冠状病毒感染,进一步证明了油乳剂灭活疫苗有效预防BCV感染。

3.2 经过对我们试制疫苗的实验室检测结果分析,所研制的灭活疫苗物理性状良好,经灭活效果及小鼠和牛只的安全性检验,证明制备的油乳剂灭活疫苗是安全的。国内有相关报道小鼠感染牛冠状病毒具有一定的敏感性[12],因此本文采用小鼠作为实验动物进行效力研究,从本文的实验结果看,BCV灭活病毒接种小鼠后,可以诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。通过小鼠免疫保护性试验结果证明了制备的油乳剂灭活疫苗具有较高的免疫效力,在一定程度上肯定了制备的灭活疫苗的可行性和有效性。通过对小鼠不同佐剂、不同免疫途径和不同免疫剂量的免疫效力比较,油乳佐剂疫苗组和铝佐剂疫苗组抗体水平差异不显著(P＞0.05),油乳佐剂疫苗组和铝佐剂疫苗组与无佐剂疫苗组抗体水平差异均为极显著(P＜0.01),不同免疫途径之间抗体水平差异不显著。不同免疫剂量对抗体水平有着一定的影响,1 mL免疫组与0.3 mL组抗体水平差异不显著(P＞0.05),但是这两个剂量组与0.1 mL剂量组抗体水平差异均为极显著(P＜0.01)。

3.3 我们通过对育成牛的免疫剂量研究,确定了疫苗的最小免疫剂量为5 mL。我们用建立的间接ELISA检测方法和传统的病毒中和试验两种方法检测抗体水平并进行相互比较验证。间接ELISA检测结果可知,第14天时就可以检测到一定抗体,在第42 d时抗体水平达到高峰,随后抗体水平缓慢下降,但是到第120天仍可以检测到比较高的抗体。中和试验结果表明,颈部肌肉注射组在42 d时达到高峰中和效价为1∶128,而皮下注射组在42 d时最大值为1∶64。此后中和抗体水平均呈下降趋势,到第120天时仍可达1∶32以上。两种方法检测的结果呈平行关系,说明妊娠母牛接种BCV油乳剂灭活苗后可以产生了良好的免疫应答反应。攻毒试验结果显示,饲喂初乳的犊牛没有发生腹泻,而对照组犊牛在攻毒12 h后不同程度发生腹泻,证明了妊娠母牛初乳中产生的高水平BCV特异性抗体对预防犊牛的BCV感染有重要作用。不少国内外学者研究报道了犊牛可通过母源抗体获得被动免疫保护[13],国内张俭伟等[4]把制备的牛轮状病毒灭活苗接种怀孕母牛,初生犊牛通过母源抗体能有效抵抗牛轮状病毒感染。

3.4 由于试验条件和时间的限制,免疫的牛体个数有限,在以后的扩大田间免疫试验中我们会进一步结合养牛生产实际,制定科学、合理的免疫程序,为BCV油乳剂灭活疫苗的市场化应用奠定坚实的基础。