陈 章，刘晓露，姚焱彬，吴琼娟，孙 裴，魏建忠，李东风，李 郁，*

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036； 2.安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥 230001)

猪丹毒(swine erysipelas)是由猪丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一种热性、急性人畜共患传染病，早在20世纪80年代，该病就与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病[1]。随着抗生素、疫苗的使用及规模化养猪业的发展，猪丹毒的危害减轻，防控被忽视。近年来，猪丹毒在我国云南、福建、江苏、安徽等地和加拿大、日本、美国等国家发病率显著上升[2-3]，临床病例从单一感染模式逐渐演变为复杂的继发感染和混合感染，猪群的发病率和死亡率显著上升[4]。

目前，预防猪丹毒的方式主要是疫苗免疫接种，猪丹毒商品化疫苗主要包括猪丹毒弱毒疫苗和猪丹毒灭活疫苗。猪丹毒弱毒疫苗存在加重猪群关节损伤、毒力返强等风险，免疫效果易受到抗生素和母源抗体的影响，难以对猪丹毒流行菌株形成较好的免疫保护作用[5]。猪丹毒灭活疫苗安全性优于弱毒疫苗，且稳定性较强，但存在免疫维持时间短、免疫效力不足等问题。在猪丹毒灭活疫苗的研制过程中，佐剂类型对疫苗免疫效果影响很大，优良的佐剂不仅能够增强疫苗抗原特异性免疫应答的能力，而且能够促进疫苗产生持久的免疫保护力。本研究拟将5种佐剂(聚合物佐剂、矿物油佐剂ISA 201 VG、蜂胶佐剂、弗氏佐剂、铝胶佐剂)和3株猪丹毒丝菌株(AEr21、AEr31和AEr32)[6]制备成15种灭活疫苗，经物理性状检验、无菌检验、安全检验合格后分别免疫小鼠，检测小鼠血清中IgG水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)，最

后通过腹腔注射和灌胃2种方式对免疫后小鼠进行攻毒，计算免疫保护率，以期筛选出具有良好免疫应答增强效果的佐剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试菌株

安徽农业大学动物传染病实验室从临床病猪分离、鉴定和保存的42株猪丹毒丝菌，血清型均为1a型。分离株经小鼠100%致死性试验(攻毒剂量为100 CFU·mL-1)筛选出4株猪丹毒丝菌，确定为强毒菌株；再通过致病力、抗原性、稳定性试验，进一步筛选出3株制苗用菌株，编号为AEr21、AEr31和AEr32(表1)。

1.1.2 攻毒菌株

攻毒菌株源自临床急性败血型病猪，由安徽农业大学动物传染病实验室分离、鉴定和保存，对小鼠的LD50为845 CFU·mL-1(猪丹毒丝菌标准菌株对小鼠的LD50为50 CFU·mL-1)，编号LA 20130329。

1.1.3 主要试剂

0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)，绍兴天恒生物科技有限公司；MONTANIDE TM GEL 01聚合物佐剂、MONTANIDE TM ISA 201 VG矿物油佐剂，法国赛比克有限公司；蜂胶佐剂，滨州畜牧兽医研究所苗立中副研究员馈赠；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，美国SIGMA公司；氢氧化化铝、氢氧化钠、吐温80，国药集团化学试剂有限公司；猪丹毒(疫苗)培养基，青岛高科园海博生物技术公司；ELISA检测细胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TFN-γ、TFN-β)试剂盒，美国RB公司。

表13株猪丹毒丝菌株信息

Table1Information of three seedling strains ofErysipelothrixrhusiopathiae

菌株 Strains分离日期 Date菌株来源 Origin分离部位 Separation发病阶段 StagesLD50/(CFU·mL-1)AEr212013-08-18蚌埠 Bengbu 脾脏 Spleen育肥 Fattening50.3AEr312014-06-20六安 Luan脑部 Brain育肥 Fattening35.5AEr322014-07-09广德 Guangde肺脏 Lung保育 Nursery10.9

1.1.4 试验动物

SPF级雌性昆明小鼠，体质量18～22 g，购于安徽医科大学试验动物中心。

1.2 灭活疫苗的制备

将3株受试菌株(AEr21、AEr31、AEr32)培养至稳定期，用终浓度为0.2%的甲醛灭活，分别确定猪丹毒丝菌灭活全菌体编号为V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32。将灭活菌株分别与矿物油佐剂ISA 201 VG(质量比1∶1)、弗氏佐剂(体积比1∶1)、聚合物佐剂(灭活菌株质量的15%)、铝胶佐剂(体积比4∶1)、蜂胶佐剂(灭活菌株质量的2‰)均匀混合处理后，制得15种猪丹毒丝菌灭活疫苗。经物理性状检验、无菌性检验和安全检验合格后，免疫小鼠。

1.3 免疫小鼠

将320只雌性昆明小鼠随机分组，每组20只，共16组，包括阴性对照组(20只)和疫苗免疫组(300只)，具体分组见表2。免疫途径为皮下多点注射，免疫剂量为每只小鼠0.2 mL(1.5×1010CFU·mL-1)。一免14 d后进行第2次免疫，2次免疫的剂量及途径均相同。

表2 小鼠分组及免疫情况

Table2Immunization of mice grouping

组别Group灭活全菌体Bacterial strain佐剂类型Adjuvant typeA1V-AEr21矿物油佐剂 ISA 201VGA2V-AEr21弗氏佐剂 Freunds adjuvant A3V-AEr21聚合物佐剂 polymer adjuvantA4V-AEr21铝胶佐剂 aluminum gel adjuvantA5V-AEr21蜂胶佐剂 propolis adjuvantB1V-AEr31矿物油佐剂 ISA 201VGB2V-AEr31弗氏佐剂 Freunds adjuvant B3V-AEr31聚合物佐剂 polymer adjuvantB4V-AEr31铝胶佐剂 aluminum gel adjuvantB5V-AEr31蜂胶佐剂 propolis adjuvantC1V-AEr32矿物油佐剂 ISA 201VGC2V-AEr32弗氏佐剂 Freunds adjuvant C3V-AEr32聚合物佐剂 polymer adjuvantC4V-AEr32铝胶佐剂 aluminum gel adjuvantC5V-AEr32蜂胶佐剂 propolis adjuvantNC生理盐水Normal saline

1.4 血清IgG抗体水平及细胞因子含量检测

一免及二免14 d后，各组小鼠眼球静脉丛采血，每组10只。参照文献[7]的方法测定小鼠血清中IgG抗体水平，依据细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1)检测试剂盒说明书，测定小鼠血清中细胞因子含量。

1.5 免疫保护率测定

二免14 d后，将各试验组剩余的10只小鼠平均分成2组，分别采用灌胃和腹腔注射方式攻毒小鼠，攻毒菌株为LA 20130329，攻毒剂量为100 LD50，阴性对照组注射等量PBS，测定各组的免疫保护率。

2 结果与分析

2.1 灭活疫苗质量检验

油乳佐剂灭活疫苗均显示为乳白色，3 000 r·min-1离心10 min，无漏乳、破乳现象出现。矿物油佐剂ISA 201 VG灭活疫苗属于水包油包水剂型，置于冷水中先凝聚不扩散，之后开始慢慢散开；弗氏佐剂灭活疫苗属于油乳剂型，置于冷水中，无扩散现象出现；矿物油佐剂ISA 201 VG和弗氏佐剂灭活疫苗分别形成液滴状需要3 s和4 s，符合油乳佐剂灭活疫苗的制备要求。待检疫苗在营养琼脂、TSA-YE及鲜血培养基中均无细菌生长，符合猪丹毒丝菌灭活疫苗的无菌要求。待检疫苗接种小鼠后均无明显不良反应，符合猪丹毒丝菌灭活疫苗的安全要求。

2.2 血清IgG抗体检测

2.2.1 V-AEr21疫苗免疫后小鼠血清IgG抗体水平

如表3所示，矿物油佐剂ISA 201VG疫苗免疫组在一免及二免14 d后血清中IgG抗体水平最高。一免14 d后，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组IgG抗体水平与蜂胶佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05)；二免14 d后，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组IgG抗体水平与铝胶佐剂、弗氏佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05)。研究结果表明，矿物油佐剂ISA 201 VG与V-AEr21制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的IgG抗体水平优于其他佐剂。

表3 小鼠血清IgG抗体检测

Table3IgG antibody test results in mouse serum

组别Group一免P/N值P/N value of thefirst immunization二免P/N值P/N value of thesecond immunizationA12.945±0.996 a5.065±0.694 aA21.210±0.136 b2.515±0.163 bA32.475±1.512 ab4.523±0.470 aA41.548±0.174 b3.470±0.383 bA51.105±0.058 b4.770±0.616 a

同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

The values in the same column followed by different letters showed significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2.2 V-AEr31疫苗免疫后小鼠血清IgG抗体水平

如表4所示，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组在一免及二免14 d血清中IgG抗体水平最高。一免14 d后，矿物油佐剂ISA 201VG疫苗免疫组IgG抗体水平与蜂胶佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05)；二免14 d后，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组IgG抗体水平与其他4组疫苗免疫组差异均显著(P<0.05)。研究结果表明，矿物油佐剂ISA 201 VG与V-AEr31制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的IgG抗体水平优于其他佐剂。

2.2.3 V-AEr32疫苗免疫后小鼠血清IgG抗体水平

如表5所示，矿物油佐剂ISA 201VG疫苗免疫组在一免及二免14 d后血清中IgG抗体水平最高。一免14 d后，矿物油佐剂ISA 201VG疫苗免疫组IgG抗体水平与其他4组疫苗免疫组差异显著(P<0.05)；二免14 d后，矿物油佐剂ISA 201 VG 疫苗免疫组IgG抗体水平与蜂胶佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05)。研究结果表明，矿物油佐剂ISA 201 VG与V-AEr32制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的IgG抗体水平优于其他佐剂。

表4 小鼠血清IgG抗体检测

Table4IgG antibody test results in mouse serum

组别Group一免P/N值P/N value of thefirst immunization二免P/N值P/N value of thesecond immunizationB12.575±0.108 a6.018±0.326 aB21.289±0.257 b1.805±0.160 cB32.155±0.155 ab3.750±0.188 bB41.333±0.543 b3.808±0.450 bB51.850±0.034 b3.318±0.126 b

表5 小鼠血清IgG抗体检测

Table5IgG antibody test results in mouse serum

组别Group一免P/N值P/N value of thefirst immunization二免P/N值P/N value of thesecond immunizationC13.863±0.170 a5.653±0.130 aC21.408±0.205 c2.483±0.233 bC32.495±0.462 b5.135±0.920 aC41.848±0.197 b3.663±0.285 bC51.043±0.054 c3.293±0.280 b

2.3 血清细胞因子检测

2.3.1 V-AEr21疫苗免疫后小鼠血清细胞因子水平

如图1所示，各疫苗免疫组小鼠血清中细胞因子水平显 著高于阴性对照组(P<0.05)。矿物油佐剂ISA 201 VG和蜂胶佐剂疫苗免疫组的MCP-1、TNF-β水平显著高于铝胶佐剂和弗氏佐剂疫苗免疫组(P<0.05)，与其他疫苗免疫组之间差异不显著(P>0.05)。矿物油佐剂ISA 201 VG和蜂胶佐剂与V-AEr21制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的细胞因子水平优于其他佐剂。

2.3.2 V-AEr31疫苗免疫后小鼠血清细胞因子水平

如图2所示，各疫苗免疫组小鼠血清中细胞因子水平显著高于阴性对照组(P<0.05)。矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组的小鼠血清中MCP-1、IL-4和TNF-β水平显著高于铝胶佐剂和弗氏佐剂疫苗免疫组(P<0.05)，与其他疫苗免疫组之间差异不显著(P>0.05)。矿物油佐剂ISA 201 VG和蜂胶佐剂与V-AEr31制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的细胞因子水平优于其他佐剂。

2.3.3 V-AEr32疫苗免疫后小鼠血清细胞因子水平

如图3所示，蜂胶佐剂、矿物油佐剂ISA 201VG疫苗免疫组小鼠血清中MCP-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β水平显著高于铝胶佐剂和弗氏佐剂疫苗免疫组(P<0.05)，与其他疫苗免疫组差异不显著(P>0.05)。矿物油佐剂ISA 201VG和蜂胶佐剂与V-AEr32制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的细胞因子水平优于其他佐剂。

图1 V-AEr21疫苗免疫后小鼠血清细胞因子含量Fig.1 Determination of cytokine level in mice immunized with V-AEr21 vaccine

图2 V-AEr31疫苗免疫后小鼠血清细胞因子含量Fig.2 Determination of cytokine level in mice immunized with V-AEr31 vaccine

2.4 免疫保护率测定结果

2.4.1 V-AEr21疫苗对小鼠的免疫保护率

如表6所示，以灌胃方式攻毒小鼠后，蜂胶佐剂和矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组的免疫保护率最高，均为100%；以腹腔注射攻毒小鼠后，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组的免疫保护率最高，为80%。矿物油佐剂ISA 201 VG和V-AEr21制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗对小鼠的免疫保护力优于其他佐剂。

2.4.2 V-AEr31疫苗对小鼠的免疫保护率

如表7所示，以灌胃和腹腔注射方式分别攻毒小鼠，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组的免疫保护率最高，分别为100%和80%。矿物油佐剂ISA 201 VG和V-AEr31制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗对小鼠的免疫保护力优于其他佐剂。

2.4.3 V-AEr32疫苗对小鼠的免疫保护率

图3 V-AEr32疫苗免疫后小鼠血清细胞因子含量Fig.3 Determination of cytokine level in mice immunized with V-AEr32 vaccine

表6V-AEr21疫苗对小鼠的免疫保护率

Table6Determination of immune protection rate of V-AEr21vaccine in mice

组别Group感染数Number ofinfection感染途径Route ofinfection接种剂量Inoculatingdose死亡数Number ofdeath死亡率Rate ofdeath/%保护率Rate ofprotection/%A15灌胃 Gavage100 LD50001005腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5012080A25灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5048020A35灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060A45灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060A55灌胃 Gavage100 LD50001005腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060

如表8所示，以灌胃和腹腔注射方式分别攻毒小鼠，蜂胶佐剂、铝胶佐剂和矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组的免疫保护率均最高，分别为80%和60%。蜂胶佐剂、铝胶佐剂、矿物油佐剂ISA 201 VG和V-AEr32制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗对小鼠的免疫保护力优于其他佐剂。

3 讨论

猪丹毒是一种老病新发的急性、热性传染病，近些年来在我国江西、安徽、江苏、云南和广州等地检出率明显增多，在日本、加拿大、美国等国家也相继出现报道[8]。根据临床病例的调查情况，猪丹毒感染已经从单一感染模式逐渐演变为复杂的继发感染和混合感染，猪群的发病率和死亡率明显上升[4]。急性猪丹毒感染具有病死率高、发病周期短等特点，应用抗生素治疗会导致细菌耐药性、药物残留及药物副作用等问题[9]，疫苗免疫是临床上防控猪丹毒的首选方法。

评估疫苗候选抗原的重要指标是该抗原是否能够刺激机体产生免疫应答及产生免疫应答的类型[10]。Th细胞是一类重要的免疫调节细胞，根据其分泌细胞因子和功能的不同可分为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-β和IL-2等，主要增强细胞免疫；Th2细胞分泌细胞因子IL-4和IL-10等，主要增强体液免疫[11]。本试验中，各佐剂疫苗免疫组较对照组均有明显的免疫应答反应，其中蜂胶佐剂和矿物油佐剂ISA201VG疫苗免疫组在二次免疫后刺激诱导小鼠分化产生的Th1和Th2细胞水平最高，与弗氏佐剂及铝胶佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05)，表明蜂胶佐剂和矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫最强。评价疫苗免疫效果的重要指标之一就是该疫苗能否刺激机体产生特异性的体液免疫应答。IgG是介导体液免疫反应的主要抗体，而良好的佐剂不仅能使宿主体内产生的IgM完全转化为IgG，更有助于增强机体对抗原的免疫应答能力。本试验中，矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组在二次免疫后产生的IgG抗体水平均最高，表明矿物油佐剂ISA 201 VG相较于其他4种佐剂可刺激机体产生更强的体液免疫反应。

表7V-AEr31疫苗对小鼠的免疫保护率

Table7Determination of immune protection rate of V-AEr31vaccine in mice

组别Group感染数Number ofinfection感染途径Route ofinfection接种剂量Inoculatingdose死亡数Number ofdeath死亡率Rate ofdeath/%保护率Rate ofprotection/%B15灌胃 Gavage100 LD50001005腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5012080B25灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040B35灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040B45灌胃 Gavage100 LD50360405腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040B55灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060

表8V-AEr32疫苗对小鼠的免疫保护率

Table8Determination of immune protection rate of V-AEr32 vaccine in mice

组别Group感染数Number ofinfection感染途径Route ofinfection接种剂量Inoculatingdose死亡数Number ofdeath死亡率Rate ofdeath/%保护率Rate ofprotection/%C15灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060C25灌胃 Gavage100 LD50360405腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040C35灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040C45灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060C55灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060

良好的佐剂不仅可以增强机体的体液免疫和细胞免疫应答能力，还能促进机体产生持久的免疫保护[12]。蜂胶佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂、白油佐剂等是当前市售的主要兽用疫苗佐剂，但由于各种佐剂的作用机理存在较大差异，理化性质也各有不同，这使得制备的灭活疫苗免疫机体后所延长抗体的持续时间和产生的免疫效果参差不齐[13]。近几年来，有很多关于动物疫苗佐剂的研究，国内外也有针对我国传统白油佐剂和铝胶佐剂的免疫效果逊于进口佐剂的报道[14-15]。目前我国细菌性疫苗佐剂主要以白油佐剂和铝胶佐剂为主，已无法满足新型细菌性疫苗的市场需求[16]。本研究在筛选猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫佐剂的过程中，不仅选用传统的蜂胶佐剂、弗氏佐剂和铝胶佐剂，同时还引入了由法国赛比克公司生产的新型聚合物佐剂和矿物油佐剂ISA 201 VG作为候选佐剂。有研究表明，矿物油佐剂ISA 201 VG可明显改善口蹄疫灭活疫苗的免疫效果[17]。猪丹毒丝菌主要经由损伤皮肤黏膜和消化道诱发感染，本研究用LD50为845 CFU·mL-1的强毒株LA 20130329(1a型)分别以腹腔注射和模拟自然感染的灌胃2种方式进行攻毒，结果显示，矿物油佐剂ISA 201 VG与V-AEr21、V-AEr31、V-AEr32制备的灭活疫苗对小鼠的免疫保护率均最高，分别为100%、100%、80%和80%、80%、60%，表明矿物油佐剂ISA 201VG灭活疫苗相较于其他4种佐剂灭活疫苗能够提供最佳的免疫保护。

油乳佐剂是一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。油乳佐剂疫苗的免疫效力高低直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等相关。油包水型(W/O)乳剂较黏稠，在机体内不易分散，但佐剂活性较好；水包油型(O/W)乳剂较稀薄，注入机体后易于分散，但佐剂活性很低；而双相油乳剂(W/O/W)则兼具了上述2种乳剂的优点，制成的双相油乳剂疫苗黏稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等特点[18]。本研究中矿物油佐剂ISA 201 VG为双相油乳剂(W/O/W)型，将其与V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32等3株猪丹毒丝菌灭活全菌体制备成灭活疫苗，对免疫小鼠的细胞免疫应答、体液免疫应答和免疫保护力方面均显示了良好的佐剂效应。

本研究将矿物油佐剂ISA 201 VG与V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32制备的灭活疫苗免疫小鼠后诱导产生的IgG抗体、细胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)水平和对强毒株的免疫保护力方面均明显优于其他佐剂，可作为制备猪丹毒丝菌灭活疫苗的候选免疫佐剂。