冯肖肖,吴赟竑,吴雪军,华炯钢,张 存,张 璐,何 杰,徐 辉

(1.浙江省动物疫病预防控制中心,浙江 杭州 311199;2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江 杭州 311199)

2013年2月开始我国上海、安徽、浙江等省市相继出现了人感染H7N9流感的病例,并迅速传播至其他省份,流行呈散发趋势[1-5]。截止到2017年12月,我国已有人感染H7N9确诊病例1 457例,死亡571例,死亡率为39.19%。H7N9亚型流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属,其基因组为8个节段的负链单股RNA病毒,在病毒增殖中极易发生变异[3-4]。2013年以来发现的H7N9流感病毒对禽类表现为低致病性,感染禽类后并无明显临床症状,并可以在禽类中持续扩散和传播[4-5]。但是随着病毒的变异和进化,2017年5月12日我国农业部首次报道了一起家禽H7N9流感疫情,该新型H7N9流感病毒HA蛋白的裂解位点发生了变异,呈现典型的高致病性禽流感分子特征,对禽类表现为高致病性,临床症状与H5亚型高致病性禽流感类似,死亡率较高,对家禽养殖和人类健康造成极大威胁[8-9]。截止到目前,我国河南、天津、陕西、内蒙、黑龙江、安徽和河北等7个省份相继发生了8起H7N9流感疫情,该疫情的快速传播和流行已经给我国养禽业带来严重的经济损失,为防范家禽H7N9疫情风险,保障公共卫生安全,农业部决定从2017年9月起全面实施H7N9免疫。

为了解和评估重组禽流感病毒H5+H7二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)(简称H5+H7二价苗)免疫禽群后抗体变化情况和免疫效果,本次试验选择了H7抗体阴性的鸡场和鸭场各1个,按照农业部高致病性禽流感免疫方案规定的免疫程序,开展了鸡鸭现场免疫试验,通过分析禽群免疫后的抗体效价和免疫合格率,评估H5+H7二价苗的免疫效果,从而为高致病性禽流感免疫方案制定提供可靠的理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要材料 14日龄雏鸡和255日龄蛋鸡由杭州余杭应田和蛋鸡场提供,主要品种为仙居鸡;14日龄雏鸭和288日龄蛋鸭由绍兴咸亨绍鸭育种有限公司提供,主要品种为绍兴麻鸭。重组禽流感H5+H7二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株和H7N9 Re-1株)由农业部指定疫苗厂家哈尔滨维科生物技术开发公司生产,生产日期为2017002,有效期为201806。禽流感H5(Re-8株)HI抗原(批号抗原2016008/阳性血清2016001),H7N9 H7-Re1株流感HI抗原(批号2016002/阳性血清2015002),均来自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋鸡免疫抗体水平的测定 选取30只255日龄的蛋鸡,按照农业部高致病性禽流感免疫方案规定的免疫程序,首次免疫后4周加强免疫1次,免疫剂量均为0.5 mL/只,在免疫后0周(255日龄)、1周(262日龄)、2周(269日龄)、3周(276日龄)、4周(283日龄)、5周(290日龄)、6周(297日龄)、7周(304日龄)和8周(311日龄)各采血进行抗体检测,记录并计算产蛋量。

1.2.2 雏鸡免疫抗体水平的测定 100只孵化至14日龄的雏鸡随机分为A、B两组进行免疫,按照农业部高致病性禽流感免疫方案规定的免疫程序,A组为“二次免疫组”,14日龄首次接种H5+H7二价灭活疫苗0.3 mL/只,35日龄二次免疫接种疫苗0.5 mL/只;B组为“一次免疫组”,只在14日龄接种1次疫苗0.3 mL/只。在免疫后0周(14日龄)、1周(21日龄)、2周(28日龄)、3周(35日龄)、4周(42日龄)、5周(49日龄)、8周(70日龄)和13周(105日龄)时分别随机取30只采血进行抗体检测。

1.2.3 蛋鸭免疫抗体水平的测定 选取30只288日龄的蛋鸭,按照农业部高致病性禽流感免疫方案规定的免疫程序,首次免疫后4周加强免疫1次,免疫剂量均为1.0 mL/只,在免疫后0周(288日龄)、1周(295日龄)、2周(302日龄)、3周(309日龄)、4周(316日龄)、5周(323日龄)、6周(330日龄)、7周(337日龄)和8周(344日龄)分别采血进行抗体检测,记录并计算产蛋量。

1.2.4 雏鸭免疫抗体水平的测定 100只14日龄的雏鸭分为A、B两组进行免疫,按照农业部高致病性禽流感免疫方案规定的免疫程序,A组为“二次免疫组”,14日龄首次接种疫苗0.5 mL/只,35日龄二次免疫接种疫苗1.0 mL/只;B组为“1次免疫组”,只在14日龄接种一次疫苗0.5 mL/只。在免疫后0周(14日龄)、1周(21日龄)、2周(28日龄)、3周(35日龄)、4周(42日龄)、5周(49日龄)、8周(74日龄)和13周(100日龄)时分别随机取30只采血进行抗体检测。

1.2.5 抗体检测 抗体检测采用国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936—2003)中血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验方法,检测同一份血清样品的禽流感H5N1 Re-8亚型、H7N9 H7-Re1亚型禽流感抗体滴度水平。

2 结果与分析

2.1 蛋鸡免疫重组禽流感H5+H7二价疫苗后的免疫抗体水平 255日龄蛋鸡首次接种重组禽流感H5+H7二价疫苗,剂量为0.5 mL/只,并于一免后4周进行2次免疫,接种剂量为1.0 mL/只。免疫结果如图1所示,蛋鸡在免疫前其体内已有H5亚型抗体,平均效价达6.43 log2,免疫抗体合格率为100%。蛋鸡H5亚型抗体水平在1免3周内逐渐上升并达到峰值10.7 log2,随后1周有所回落;二免后5周内抗体水平始终维持在8.33～9.50 log2之间。同时,在蛋鸡免疫周期内,H5亚型免疫抗体合格率始终为100%。

蛋鸡在免疫前其体内无H7亚型抗体,一免后H7亚型抗体水平迅速上升,一免后2周和4周抗体效价分别达到了6.10 log2和8.30 log2;二免后H7抗体水平继续上升,至二免后2周达到峰值10.13 log2,随后有所下降,至第8周抗体效价为8.33 log2。同时,H7亚型免疫抗体合格率在一免后2周迅速上升至100%,免疫后2周～8周始终保持在100%。

以上结果显示,蛋鸡在免疫接种重组禽流感H5+H7二价疫苗二次后,H5亚型抗体水平因母源抗体影响而缓慢上升,H7亚型抗体水平迅速上升,至免疫后期两者抗体水平变化趋势相近,抗体滴度都在8 log2以上。因此,重组禽流感H5+H7二价疫苗在免疫蛋鸡后可以快速达到稳定良好的H5和H7亚型免疫抗体水平及100%的免疫抗体合格率,具有良好的免疫效果。

图1 蛋鸡免疫后H5和H7亚型免疫抗体水平

2.2 雏鸡免疫重组禽流感H5+H7二价疫苗后的免疫抗体水平

2.2.1 雏鸡一次免疫后的抗体水平 雏鸡只在14日龄进行一次免疫接种,剂量为0.3 mL/只。免疫结果如图2所示,免疫前雏鸡体内的H5亚型母源抗体平均效价为2.53 log2,免疫抗体合格率为21.88%。免疫接种后1周母源抗体消失,H5亚型免疫抗体水平逐渐上升,第3周抗体水平即可达到5.37 log2,并在一免后4周达到峰值7.57 log2,随后逐渐下降,第13周(105日龄)抗体平均效价为4.1 log2。同时,雏鸡H5亚型免疫抗体合格率在免疫后3周达到合格(86.67%),第4周和第5周保持在100%,然后有所下降,至免疫后13周仍达到合格(80%)。

雏鸡免疫前体内无H7亚型抗体,免疫接种1周后母源抗体消失,H7亚型抗体水平迅速上升,第2周和第3周抗体平均效价分别可达到4.17 log2和6.37 log2,至免疫后4周达到峰值7.43 log2,随后逐渐下降,第13周抗体平均效价为3.87 log2。雏鸡H7亚型免疫抗体合格率在免疫后2周达到合格(73.33%),第3周至第5周都维持在100%,随后下降,第13周仍合格为83%。

以上结果显示,雏鸡免疫接种一次重组禽流感H5+H7二价疫苗后,第3周开始H5和H7亚型两种免疫抗体合格率均在70%合格线以上波动,第4周达到最高水平,随后逐渐下降,免疫8周以后抗体效价均低于6 log2。与蛋鸡免疫后情况相似,免疫初期H7亚型抗体上升速率同样快于H5亚型抗体,这可能是因为疫苗本身H7亚型抗原含量高于H5亚型引起的。这表明,重组禽流感H5+H7二价疫苗在免疫雏鸡一次后可以提供一定的免疫保护效果,但是不能产生较高的抗体水平,免疫效果欠佳。

2.2.2 雏鸡二次免疫后的抗体水平 雏鸡在14日龄和35日龄分别进行剂量为0.3 mL/只和0.5 mL/只的免疫接种。免疫结果如图3所示,在首免后3周进行二次免疫后,H5和H7亚型免疫抗体水平均继续保持上升趋势,至第5周达到峰值,抗体平均效价分别为9.10 log2和9.70 log2,随后逐渐下降,第13周(105日龄)H5和H7抗体平均效价分别为7.60 log2和7.10 log2。同时,H5和H7亚型免疫抗体合格率在二免后均持续保持在100%。

以上结果显示,雏鸡免疫接种两次重组禽流感H5+H7二价疫苗后,H5和H7亚型免疫抗体合格率分别在第4周和第3周达到100%,并随后保持至第13周试验结束。同时对比只免疫一次的雏鸡组(图4),雏鸡二次免疫后各周H5和H7亚型抗体水平均进一步升高了2个滴度左右,并持续稳定在7 log2以上,在免疫后5周以后两者存在极显著差异(P＜0.01)。这表明,雏鸡在免疫重组禽流感H5+H7二价疫苗两次后,可以保证雏鸡体内存在稳定持续的高抗体水平和100%的免疫抗体合格率,具有显著的免疫保护效果。

图3 雏鸡二次免疫后H5和H7亚型免疫抗体水平

图4 雏鸡免疫一次和两次后免疫抗体水平差异比较

2.3 蛋鸭免疫重组禽流感H5+H7二价疫苗后的免疫抗体水平 288日龄蛋鸭首次接种重组禽流感H5+H7二价疫苗后4周进行二次免疫,接种剂量均为1.0 mL/只。免疫结果如图5所示,免疫前蛋鸭体内H5亚型抗体平均效价为5.17 log2,免疫抗体合格率为86.67%。一免后H5亚型免疫抗体水平在2周迅速上升至9 log2以上,于第4周达到峰值9.73 log2;二免后H5抗体水平继续维持在8.53～9.23 log2之间。同时,蛋鸭H5亚型免疫抗体合格率在免疫后2周即可达到100%,并持续维持至第8周。

免疫前蛋鸭体内并无H7亚型抗体,免疫后H7抗体水平快速上升,一免后2周即可达到7.43 log2,随后保持稳定;二免后H7抗体水平进一步上升,于第6周达到峰值10.13 log2,随后保持在9 log2左右的高水平。同样的,蛋鸭H7亚型免疫抗体合格率在一免后2周迅速上升至100%并持续保持至第8周。

以上结果显示,蛋鸭在免疫接种重组禽流感H5+H7二价疫苗后可以快速产生并持续保持高水平的H5和H7亚型免疫抗体和100%免疫抗体合格率,具有良好的免疫效果。

图5 蛋鸭二次免疫后H5和H7亚型免疫抗体水平

2.4 雏鸭免疫重组禽流感H5+H7二价疫苗后的免疫抗体水平

2.4.1 雏鸭1次免疫后的抗体水平 雏鸭只在14日龄进行一次免疫接种,剂量为0.5 mL/只。免疫结果如图6所示,免疫前雏鸭体内的H5亚型母源抗体平均效价为0.83 log2,免疫抗体合格率为3.33%。免疫接种后1周母源抗体消失,H5亚型免疫抗体水平开始缓慢上升,并在免疫后4周达到峰值4.33 log2,随后逐渐下降,至第13周(105日龄)抗体平均效价为1.77 log2。同时,雏鸭H5亚型免疫抗体合格率只有在免疫后4周才能达到70.00%,其余免疫周期内均处于合格线以下。

图6 雏鸭一次免疫后H5和H7亚型免疫抗体水平

雏鸭免疫前体内无H7亚型抗体,免疫接种后H7亚型免疫抗体水平迅速上升,第3周抗体效价达4.07 log2,并在一免后4周达到峰值5.63 log2,随后迅速下降,第8周以后抗体效价下降为4 log2以下。H7亚型免疫抗体合格率在一免后4周才能达到合格(93.33%),随后有所下降,第8周后下降为70%以下。

以上结果显示,雏鸭免疫接种一次重组禽流感H5+H7二价疫苗后,大部分免疫周期内H5和H7亚型免疫抗体合格率均达不到70%的合格线,于第4周达到峰值后逐渐下降。尽管免疫初期H7亚型抗体上升速率和抗体效价均快于和高于H5亚型抗体,但免疫后各周抗体效价始终均低于6 log2。表明,重组禽流感H5+H7二价疫苗在免疫雏鸭一次后H5和H7亚型免疫抗体水平和合格率整体不高,免疫效果不理想。

2.4.2 雏鸭2次免疫后的抗体水平 雏鸭在14日龄和35日龄分别进行剂量为0.5 mL/只和1.0 mL/只的免疫接种。免疫结果如图7所示,二次免疫后1周H5和H7亚型免疫抗体水平均迅速上升至峰值,效价分别为8.13 log2和9.16 log2,随后开始逐渐下降,至第13周(105日龄)H5和H7抗体平均效价分别为4.93 log2和5.03 log2。同时,H5和H7亚型免疫抗体合格率在二免后均持续保持在70%以上。

以上结果显示,雏鸭免疫接种两次重组禽流感H5+H7二价疫苗后,H5和H7亚型免疫抗体合格率均在二免后保持70%以上。同时,比较雏鸭免疫一次和两次后免疫抗体水平差异(图8),雏鸭二次免疫后各周H5和H7亚型抗体水平均明显比只一次免疫组的高3个滴度左右,二免后抗体平均效价均可维持在4.93 log2以上,在二免后1周以后两者存在极显著差异。表明,重组禽流感H5+H7二价疫苗在免疫雏鸭两次后,免疫效果明显要好于一次免疫效果,但弱于于雏鸡和蛋鸡组免疫效果。

图7 雏鸭二次免疫后H5和H7亚型免疫抗体水平

图8 雏鸭免疫一次和两次后免疫抗体水平差异比较

2.5 重组禽流感H5+H7二价疫苗免疫后的产蛋影响 临床观察结果显示(图9),除鸡群一免后两天饮水量有所增加外,鸡群免疫后的采食饮水、精神状态、粪便等都保持正常;鸭群免疫后采食量有所下降,1周后恢复正常,其余精神状态和粪便等并无明显变化。蛋鸡的产蛋量在免疫前后未见明显变化,只是在免疫接种、采样后会出现短暂下降,之后2～3 d即恢复到正常水平。蛋鸭产蛋率在免疫前后有比较明显,免疫接种后下降幅度大可达16% ～30%,二免后产蛋率逐渐稳定恢复正常水平。

图9 蛋鸡和蛋鸭免疫后产蛋率变化情况

3 讨论

低致病性H7N9流感病毒一旦发生变异后对禽类表现为高致病性,2017年以来H7N9流感变异毒株给我国家禽养殖业带来了严重的影响和损失[7-8]。国内外禽流感防控实践措施表明,疫苗免疫是防治禽流感的关键措施之一[6,10-11]。因此,家禽H7N9流感的全面免疫是目前高致病性禽流感防控的重要措施,切实有效的保障全国禽类养殖业生产安全和公共卫生安全。通过蛋禽2次免疫的现场免疫试验(一免后4周二免)及雏禽的1次和2次免疫(一免后3周二免)的现场免疫试验,结果分析表明：(1)重组禽流感H5+H7二价疫苗对蛋鸡和蛋鸭都具有良好的免疫效果,免疫后2周H5和H7亚型免疫抗体水平均能达到100%的免疫合格率,并能持续保持至二免后4周;(2)重组禽流感H5+H7二价疫苗对雏鸡也具有较好的免疫效果,免疫一次时H5N1 Re-8和H7N9 Re-1抗体水平分别在一免后3周和2周达到70%以上的免疫合格率,并维持到一免后13周;进行二次免疫后,H5N1 Re-8和H7N9 Re-1抗体滴度明显高于一次免疫,并维持在较高的抗体水平。其中,H5 Re-8相对于H7N9 Re-1抗体效价产生较慢的原因可能与雏鸡母源抗体的影响有关;(3)重组禽流感H5+H7二价疫苗对雏鸭的免疫效果相对较差,H5N1 Re-8抗体水平在一次免疫周期内处于70%合格率以下,一次免疫效果不理想;二免后1周H5和H7亚型抗体水平均能达到80%以上的合格率。同时,雏鸭抗体水平和合格率均要明显低于鸡群免疫效果。两者免疫后在H5和H7抗体水平上能够相差0.37～3.74 log2和1.14～2.30 log2个滴度,H5和H7抗体合格率在一免后最高可相差了53和40个百分点,二免后最高相差了20和10个百分点。因此,雏鸭必须进行二次免疫才能达到满意的免疫效果;(4)重组禽流感H5+H7二价疫苗免疫后对蛋禽产蛋率有一定程度的影响。蛋鸡产蛋率下降较少且很快恢复正常水平,蛋鸭产蛋率变化显著,恢复时间也较长,表明蛋鸭比蛋鸡更易受到应激的影响。由于试验需要蛋禽免疫后每周采集血样测定抗体,免疫试验中观察到的蛋鸭产蛋影响时间较长与采血导致的应激反应极大相关。

因此,按照农业部推荐的免疫程序,对生长期少于70日龄的鸡一次免疫,生长周期70日龄以上的肉鸡和蛋鸭首次免疫后3～4周进行二次免疫,免疫后H5和H7亚型免疫抗体效价均可达到较高水平并维持较长时间,能满足本省高致病性禽流感防控要求。而对生长周期少于70日龄的肉鸭在一次免疫后3周需要进行加强免疫才能保证免疫效果,为减少风险建议免疫2次以上。同时,在免疫接种蛋禽时要尽量减少接种应激带来的产蛋率下降的影响,可采取开产前强化免疫、疫苗回温注射、添加适量多种维生素等措施。另外,重组禽流感H5+H7二价疫苗中抗原含量因不同生产厂家和各批次间的差异可能会有所不同,从而造成免疫后H5和H7亚型免疫抗体水平差异。因此,免疫效果的持续监测是当前高致病性禽流感免疫防控工作中的重要环节。家禽免疫接种后及时进行抗体水平的免疫监测和效果评价,对禽群中出现免疫副反应、免疫抗体不达标、免疫失败等情况要及时处理,进行补免或重免,以确保本省家禽高致病性禽流感的全面免疫效果。