杨 慧，陈德经,,*，夏冬辉，辛 茜，陈海涛，金文刚

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；3.陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001；4.汉中龙鲵生物工程股份有限公司，陕西 汉中 723001）

大鲵（Andrias davidianus），俗称“娃娃鱼”，属有尾目，隐鳃鲵科，是现存个体最大的两栖动物，有“生物界活化石”的美称[1]。大鲵被列入人工繁育国家重点保护水生野生动物名录，农业部批准人工繁育养殖的子二代大鲵可加工利用[2]。大鲵具有很高的食用和药用价值，黄世英等[3]对人工养殖的大鲵肉营养成分分析表明，大鲵肉蛋白质含量高，必需氨基酸、鲜味氨基酸含量丰富，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值高达3.15，远高于鸡蛋、猪肉、虾。刘绍等[4]分析了大鲵肌肉中必需脂肪酸，主要为亚油酸、亚麻酸、DHA、花生四烯酸。此外，大鲵肌肉中含有钙、铁、锌、硒等矿质物质，其中锌含量远高于鱼、虾、蟹、贝类等[5]。现代医学认为，经常食用大鲵肉可以益智、延缓衰老、提高造血和免疫功能，对心脑血管疾病、恶性贫血、恶性肿瘤、癌症等有很好的预防作用。曹洁等[6]研究了大鲵肉粉对小鼠免疫功能和抗疲劳作用的影响，表明大鲵肉粉具有增强小鼠免疫力和抗疲劳的功能。此外，大鲵体内含金属硫蛋白，能清除人体自由基和重金属离子，具有很好的解毒作用[7-8]。

大鲵肉粉是大鲵保健品的原料之一。目前，市场售卖的活体大鲵约50～100 元/斤，将其加工成大鲵肉粉其价格将翻几番，有不法商贩为牟取暴利，会在大鲵肉粉中掺入与其颜色较接近的低价位肉类和其他物质，如鱼粉、淀粉等。这不仅损害消费者的利益，同时也扰乱了大鲵市场的健康发展。因此，建立一种快速识别掺伪大鲵肉粉的方法就显得尤为重要。传统肉类掺伪鉴别常用方法有感官检验法[9]、生物技术法[10]、光谱法[11]和电子感官鉴别技术（电子鼻和电子舌）[12]等，但这些方法存在耗时长、分析过程繁琐、重现性差且成本高等缺点。近年来，近红外光谱技术因具快捷、简便、无损且重复性好等优点[13]，已广泛应用于农畜产品[14]、果蔬[15]、乳制品[16]、油脂品[17]和肉制品掺伪鉴别中。张丽华等[18]采用近红外光谱结合支持向量机模型对牛肉中掺杂鸭肉进行鉴别，其建模集正确率为97.09%，检验集正确率为94%。牛小颖等[19]采用近红外光谱结合化学计量法鉴别了驴肉掺伪，校正集和预测集的判别正确率均为100%。Morsy等[20]采用近红外光谱技术对新鲜及冷冻碎牛肉中掺杂猪肉、修剪脂肪、内脏等进行了鉴别，其所建模型的识别正确率高达100%。目前鲜见近红外鉴别大鲵肉粉的相关文献。

偏最小二乘（partial least square，PLS）法是目前近红外光谱分析中应用最广泛的数据建模方法，其可以综合筛选光谱数据，提取信息变量[21]。其中，偏最小二乘-判别分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）法[22]和偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析法[23]分别用于判别分析和定量校正。

本实验以大鲵肉粉为研究对象，分别掺入不同比例的草鱼肉粉、江团鱼肉粉和土豆淀粉，探索采用PLS法定性定量分析掺伪大鲵肉粉的可行性，以期为掺伪大鲵肉粉的快速检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

大鲵肉样 汉中龙鲵生物工程股份有限公司；草鱼、江团鱼 汉中当地水产店；土豆淀粉 自制。

1.2 仪器与设备

VERTEX 70红外光谱仪（配备OPUS 7.5光谱采集软件和漫反射积分球附件） 德国布鲁克有限公司；LGJ-10B冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；BCD-486WDEG冰箱 青岛海尔股份有限公司；XH-D旋涡混合器 上海利闻科学仪器有限公司；DFY-1000摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；ME104E电子分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

大鲵肉样、江团鱼肉样和草鱼肉样经液氮速冻、粉碎后置于冷冻干燥机中干燥，研磨，过60 目筛，得到细粉。然后在大鲵肉粉中分别掺入质量分数为1%～40%（1%、2%、3%…40%）的江团鱼肉粉（n=40）、草鱼肉粉（n=40）和土豆淀粉（n=40），保持混合样总量为0.300 g，置于2 mL的离心管中，旋涡混合器上混匀。

1.3.2 光谱采集

将样品放入石英杯中混合均匀，以仪器内置背景为参比，采用积分球漫反射方式采集样品（40 个大鲵纯肉样、40 个大鲵掺江团鱼肉样、40 个大鲵掺草鱼肉样和40 个大鲵掺土豆淀粉样）的近红外光谱图，扫描范围4 000～10 000 cm－1，分辨率8 cm－1，累计扫描次数64 次，每个样本重复扫描3 次，用于后续分析。

1.4 数据处理方法

对采集的160 个光谱进行2分类和4分类的分类建模分析，每类随机选择80%的样本作为校正集，用于建立PLS-DA模型；每类剩余20%的样本作为测试集，用于验证模型的预测能力。对原始光谱经多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、标准正态变换（standard normal variate transformation，SNV）和一阶导数（1st derivative，1SGD）、1SGD+MSC、1SGD+SNV等光谱预处理后，对所建判别模型的预测效果进行评价。

同时，为快速检测掺伪样的纯度，采用PLSR分析法分别建立3 类掺伪样中的大鲵肉粉的质量分数的定量校正模型。3 类掺伪样定量模型中，每类分别随机选取70%的样本（28 个样本）为校正集，用于建立定量校正模型，其余30%的样本（12 个样本）为测试集，用于验证模型的预测性能。以校正集的10-折交互验证误差均方根（root mean squares error of cross-validation，RMSECV）确定建模的主因子数，以校正集的均方根误差（root mean square for calibration，RMSEC）和校正集相关系数（R2c）为指标优化模型参数，以测试集的均方根误差（root mean square for prediction，RMSEP）和测试集的相关系数（Rp2）考察模型的预测性能。

在Matlab R2014a环境下，采用PLS tool box 5.5程序进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 近红外光谱图

2.1.1 大鲵纯样和掺伪物近红外光谱图

由图1可知，大鲵纯肉样的近红外光谱曲线形状相似，选取的40 条大鲵制备的肉粉差异不大。该批次的大鲵鱼苗均购置于同一养殖户，其种龄、生长环境、饲养环境完全相同，说明商品大鲵制备的肉粉无差异。近红外光谱主要反映的是含氢元素的化学基团分子振动的倍频和合频吸收信息[24]，大鲵纯肉粉的光谱在8 408、5 761、6 606、4 350 cm－1和4 047 cm－1附近有特征吸收峰。8 408、5 761 cm－1是C—H伸缩振动的二级倍频，6 606 cm－1是O—H伸缩振动的二级倍频，4 597 cm－1是N—H伸缩振动和N—H变角振动的组频，4350 cm－1是O—H伸缩振动和O—H变角振动的组频，4 047 cm－1是C—H伸缩振动和C—H变角振动的组频[25]。

图1 大鲵纯肉样的近红外光谱图Fig. 1 Near-infrared spectra of pure Chinese giant salamander meat samples

图2 4 种纯样的平均光谱图Fig. 2 Average spectra of four pure samples

由图2可知，土豆淀粉的近红外图谱和其他肉类的图谱有显著差异，纯江团肉粉、纯草鱼肉粉纯和大鲵肉粉的近红外光谱图形状极为相似，这可能是因为它们都以蛋白质物质为主。在波数为8 700～6 500 cm－1、5 000～4 000 cm－1范围内，可用肉眼识别3 种纯肉样的光谱图，且江团鱼粉的吸光度最大的，大鲵肉粉的吸光度最低。肉类品种不同，其所含有的化学成分也不同，因此表现出不同的近红外光谱吸收值，这也是近红外技术应用于肉类掺假检验的基本原理[26]。土豆淀粉是一种多糖，其组成成分与肉制品有显著差异，因此在4 000～7 000 cm－1波数范围内，肉眼可直接识别纯大鲵肉粉和纯土豆淀粉。

2.1.2 掺伪大鲵肉粉的近红外光谱图

图3 大鲵肉粉掺伪近红外光谱图Fig. 3 Near infrared spectra of adulterated Chinese giant salamander meat powder

比较图2与图3可以看出，大鲵肉粉掺伪光谱图出现谱峰重叠现象，且随着掺假物质量分数（从下到上递增）的不断增加，重叠现象随之加重，很难用肉眼直接区分大鲵纯肉样和大鲵掺伪样，此时就需要结合化学计量学方法进行数据分析。

2.2 定性分析结果

表1 不同光谱预处理方法所建掺伪大鲵肉粉PLS-DA（2分类）模型判别结果Table 1 Discrimination of adulterated and authentic samples by PLS-DA models with different spectral pretreatments

近红外光谱建模分析时，其谱图中的噪音、基线漂移、光散射等现象会影响模型的性能，因此需要对原始光谱预处理，以提高模型准确性[24]。目前，有许多预处理方法可用于近红外光谱数据的处理[27]。在确定具体方法或组合方式前，很难确定最佳的光谱预处理方法[28-29]。近年来，有人提出了基于实验设计的方法解决这一问题[30-31]，但仍有不足之处。因此，试错法仍然是目前最常用的方法。本实验采用MSC、SNV、1SGD、1SGD+MSC和1SGD+SNV五种光谱预处理方法。光谱预处理后，采用PLS-DA方法分别建立2分类和4分类的分类判别模型，以此确定最佳的光谱预处理方法。

由表1可看出，模型预测效果不一，经光谱预处理后，模型的准确率均有提高。其中经1SGD+MSC光谱预处理后，模型校正集和预测集的准确率均为100%。该模型可以区分开大鲵纯肉样和掺伪样。

表2 不同光谱预处理方法所建掺伪大鲵肉粉PLS-DA（4分类）模型判别结果Table 2 Discrimination of three adulterated samples and authentic sample by PLS-DA models with different spectral pretreatments

由表2可以看出，各类判别模型的主因子数均为5，但模型校正集和预测集的准确率不同。其中1SGD+MSC光谱预处理效果最优，校正集和测试集的准确率高达100%。其他预处理方法均有误判数，但准确率也在原始光谱之上。该模型可以区分开大鲵纯肉样、大鲵掺江团鱼肉样、大鲵掺草鱼肉样和大鲵掺土豆淀粉样。

这可能是由于一阶导数可对样品差异导致的基线漂移具有消除作用，多元散射校正可消除样品颗粒度和颗粒大小不均匀造成的散射影响，因此谱带特征有所强化，谱带重叠现象有所改善[24,32]。成芳等[33]比较了不同光谱预处理方法（MSC、SNV、一阶导数及不同点数平滑）对不同部位猪肉糜所建的PLS-DA模型的影响，发现一阶导数光谱预处理方法可使模型校正集和预测集的准确度分别达到100%和96%。Kamruzzaman等[34]比较了MSC、SNV、一阶导数和二阶导数等光谱预处理方法对牛肉掺马肉定量模型的影响，发现相较于处理过的光谱，原始光谱的效果更好。徐文杰等[35]为建立最优的淡水鱼鱼种鉴别模型，采用MSC、标准化、正交信号校正、去趋势校正、SNV、平滑、导数、基线校正等20 种光谱预处理方法，发现经过标准化处理后，模型效果最优。由此可见，最优光谱预处理方法的选择和确定随分析检测对象的不同而存在差异。故本实验确定1SGD+MSC为最优光谱预处理方法。

2.3 定量分析结果

建立PLS定量模型时，主因子数目会显著影响PLS定量分析模型的预测结果。主因子数目过多，模型会出现过拟合现象；主因子数过少，模型的预测能力弱[36]。本实验采取10-折交互验证法，根据校正集RMSECV的变化值判断主因子数对PLS定量分析模型的影响，获得定量分析的最适主因子数。

图4 江团鱼肉粉掺伪定量分析结果Fig. 4 Quantitative model of adulteration of longsnout catfish meat powder

由图4A可见，大鲵掺江团鱼肉粉定量分析的最适主因子数为6。图4B中大鲵掺江团鱼肉粉定量模型的RMSEC和RMSEP分别为1.14%和0.83%，为0.990 6，为0.994 4。

图5 草鱼肉粉掺伪定量分析结果Fig. 5 Quantitative model of adulteration of grass carp meat powder

由图5A可见，大鲵掺草鱼肉粉定量分析的最适主因子数为11。图5B中大鲵粉掺草鱼肉粉定量模型的RMSEC和RMSEP分别为1.39%和0.89%，R2c为0.986 4，Rp2为0.992 4。

图6 土豆淀粉掺伪定量分析结果Fig. 6 Quantitative model of adulteration of potato starch

由图6可见，大鲵掺土豆淀粉定量分析的最适主因子数为10。图6B中大鲵粉掺土豆淀粉定量模型的RMSEC和RMSEP分别为0.88%和1.22%，Rc2为0.993 3，Rp2为0.990 8。

3 结 论

运用近红外光谱技术结合PLS-DA建立掺伪大鲵肉粉的定性鉴别方法。PLS-DA模型中，比较大鲵肉粉及其掺伪物的原始光谱以及经MSC、SNV、1SGD、1SGD+MSC和1SGD+SVN等光谱预处理后所建模型判别效果。确定1SGD+MSC为最佳光谱预处理方法，所建2分类和4分类模型校正集与预测集的准确率均为100%。

运用近红外光谱技术结合PLSR建立掺伪大鲵肉粉定量校正模型，大鲵肉粉掺江团鱼肉粉、大鲵肉粉掺草鱼肉粉、大鲵肉粉掺土豆淀粉模型RMSEC分别为1.14%、1.39%、0.88%，为0.990 6、0.986 4、0.993 3；RMSEP分别为0.83%、0.89%、1.22%，为0.994 4、0.992 4和0.990 8，所建PLSR定量模型有很好的预测性能。近红外光谱技术结合化学计量学方法能够对大鲵肉粉进行掺伪鉴别和纯度检测。