张 妮，周 静*，胡守江，叶 青，彭亚锋，陆 壹

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233）

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）在生物体内经脂肪酶水解成氯丙醇[1-2]，而氯丙醇中研究最多的是3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD），3-MCPD具有神经、肾脏、遗传毒性以及潜在的致突变性[3-5]，是国际公认的食品污染物。氯丙醇多以酯的形式存在于精炼植物油和富含油脂食品中，且酯的含量远高于其游离态的氯丙醇[6-7]。由于棕榈油、菜籽油等精炼植物油在婴幼儿配方奶粉中的广泛使用，导致婴幼儿配方奶粉中也存在一定程度的氯丙醇酯污染[8-10]，但因缺乏足够的科学数据和膳食数据支持，目前我国尚未制定婴幼儿配方奶粉以及其他食品中氯丙醇酯的限量。

食品中氯丙醇酯的检测目前主要有直接测定法与间接测定法：直接测定法采用液相色谱-质谱法对具体的氯丙醇酯单体分别定量，不需衍生，前处理较为简单[11-13]，但因氯丙醇酯种类较多且标准品不易获得影响总量的计算；间接测定法采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术通过酯交换反应将氯丙醇酯水解为氯丙醇，以氯丙醇的含量表征氯丙醇酯的含量[14-16]，该方法可测定氯丙醇酯的总量，能准确反映食品中氯丙醇酯的真实污染状况，更加适合膳食暴露研究。

国外对各类食品包括植物油、咖啡、糕点、饼干、婴幼儿食品中3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-monochloropropane-1,2-diol ester，3-MCPDE）的研究较多，国内主要集中于研究植物油中的3-MCPDE和2-氯-l,3-丙二醇脂肪酸酯（2-monochloropropane-1,3-diol ester，2-MCPDE），国内外同时检测婴幼儿配方奶粉中4 种氯丙醇酯并对其总量进行风险评估的文献较少[9-10,17]，且忽略了婴幼儿配方奶粉同时存在缩水甘油酯[18-19]的可能情况，而缩水甘油酯在一定条件下能转化成氯丙醇酯，若前处理条件控制不当，会造成氯丙醇酯的含量测定值偏高。本研究在GB 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的测定》基础上，进一步优化完善，并结合考虑如何防止样品中可能存在的缩水甘油酯转化成氯丙醇酯，通过对水解条件、pH值、萃取溶剂、衍生条件的系统性优化，利用GC-MS可靠的定性能力，再结合稳定性同位素稀释技术，大大提高了检测方法的准确度和精密度，并对50 份上海市售婴幼儿配方奶粉的氯丙醇酯污染水平进行调查分析和风险暴露评估，为生产企业进行产品的安全控制和政府部门制定婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯的限量提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

共50 份婴幼儿配方奶粉样品（国产奶粉33 份，进口奶粉17 份），购于商超、母婴店和各大电商平台，其中0～6 月龄奶粉15 份、6～12 月龄奶粉18 份、12～36 月龄奶粉17 份。空白基质特级初榨橄榄油和脱脂奶粉购于大型商超。

标准品：3-MCPD棕榈酸二酯（纯度＞96.5%）日本和光（Wako）纯药工业株式会社；2-MCPD硬脂酸二酯（纯度＞98.0%）、D5-2-MCPD硬脂酸二酯（纯度＞98.0%）、D5-2,3-二氯-1-丙醇（2,3-dichloropropane-1-ol，D5-2,3-DCP）（纯度＞98.0%） 加拿大TRC公司；1,3-DCP（纯度＞99.0%）、2,3-DCP（纯度＞98.6%）德国Dr Ehrenstorfer公司；D5-3-MCPD棕榈酸二酯（纯度＞98.5%）、D5-1,3-DCP（纯度＞98.9%） 加拿大C/D/N ISOTopes公司。由于市场上暂无1,3-DCPE、2,3-DCPE及其相应内标售卖，因此加标实验用l,3-DCP、2,3-DCP代替1,3-DCPE、2,3-DCPE，内标用D5-1,3-DCP、D5-2,3-DCP代替D5-1,3-DCPE、D5-2,3-DCPE。

甲醇钠（含量＞96%） 日本TCI公司；七氟丁酰基咪唑（heptafluoro-butyryl imidazole，HFBI，含量＞97.5%） 德国Sigma公司；无水乙醚、石油醚、甲醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷、异辛烷（均为色谱纯）美国Fisher公司；无水乙醇、无水硫酸钠、氯化钠、浓硫酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；EXtrelut NT硅藻土固相萃取柱 德国Merck公司；无水硫酸镁-无水乙酸钠（4∶1，m/m） 沃特世科技（上海）有限公司。

标准溶液的配制：称取各标准品适量（精确至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，分别配制成200 mg/L（均以相应的氯丙醇计）的单一标准储备液，于－20 ℃保存。将标准储备液用正己烷稀释并定容，分别配制成2.0 mg/L（均以相应的氯丙醇计）的氯丙醇酯混合标准工作液和氘代氯丙醇酯混合标准工作液。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司；MS104S电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；涡旋混合器、旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；SK8210LHC超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；DL-5C低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取

称取奶粉4 g（精确至0.000 1 g）于抽脂瓶中，加入10 mL 65 ℃去离子水溶解，后加入2 mL氨水，涡旋混匀后放置于65 ℃水浴中15～20 min。取出冷却后，依次加入10 mL无水乙醇、25 mL乙醚和25 mL石油醚，充分振荡1 min。静置后取上层液于250 mL脂肪收集瓶中；抽脂瓶中再加入15 mL乙醚和15 mL石油醚重复提取2 次，将脂肪收集瓶放在水浴锅上蒸干溶剂，置于（100±2）℃烘箱干燥1 h，冷却后称质量（精确至0.000 1 g），通过与空管的质量差值计算试样的脂肪含量。提取的脂肪置于4 ℃保存，供后续氯丙醇酯含量测定用。

1.3.2 样品水解、净化、衍生

称取上述提取的脂肪0.1 g（精确至0.000 1 g）于15 mL塑料离心管内，加入500 μL叔丁基甲基醚-乙酸乙酯（8∶2，V/V），后准确加入100 μL 2.0 mg/L氘代氯丙醇酯混合标准工作液，超声20 min。加入1.0 mL 0.1 mol/L甲醇钠甲醇溶液，涡旋并计时5 min后，加入75 μL中和剂（浓硫酸-饱和硫酸钠溶液（1∶40，V/V）），充分涡旋。加入3 mL正己烷去除油脂等杂质，水相层全部转入EXtrelut NT硅藻土固相萃取柱中，平衡静置10 min。加入20 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩近干，无水硫酸钠脱水，用2 mL异辛烷复溶。迅速加入50 μLHFBI，涡旋后室温放置30 min。加饱和氯化钠溶液2 mL，终止反应，取上清液进样。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛细管柱；不分流进样；进样体积：1.0 μL；进样口温度：280 ℃；载气：高纯氦气，恒流，流速1.0 mL/min；程序升温：40 ℃保持1 min，然后以2 ℃/min程序升温至80 ℃，再以30 ℃/min升温至300 ℃，保持2 min。

1.3.3.2 质谱条件

电离方式：电子电离源；电离能量：70 eV；监测方式：选择离子监测模式；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；传输线温度280 ℃；溶剂延迟6 min。主要方法学参数见表1。

1.3.4 样品中指标测定

1.3.4.1 氯丙醇酯的含量

样品中氯丙醇酯含量计算公式如下：

式中：X为奶粉中氯丙醇酯（以氯丙醇计）含量/（mg/kg）；c为由线性方程计算得到的试样溶液中氯丙醇酯（以氯丙醇计）的质量/ng；c0为试样空白溶液中氯丙醇酯（以氯丙醇计）的质量/ng；f为稀释倍数；m为脂肪的取样量/g；F为奶粉中脂肪的质量分数/%；1 000和100为换算系数。

1.3.4.2 氯丙醇酯的暴露量

氯丙醇酯暴露量计算公式如下：

式中：I为氯丙醇酯（以氯丙醇计）的暴露量/（μg/kg）；X为奶粉中氯丙醇酯（以氯丙醇计）的含量/（mg/kg）；S为每日奶粉摄入量/g；M为婴幼儿体质量/kg。

婴幼儿在不同月龄体质量与奶粉摄入量见表2。

表2 不同月龄婴幼儿体质量和婴幼儿配方奶粉日摄入量Table 2 Body mass and daily intake of formula milk powder for infants of different ages

1.4 数据和图像处理方法

用Excel 2013计算平行数据的算术平均值并作图。

2 结果与分析

2.1 碱水解条件的优化

间接测定氯丙醇酯多采用甲醇钠-甲醇溶液[20-21]或硫酸甲醇[16,22]溶液进行酯交换反应。根据文献报道[23]，3-MCPD的前体物质如缩水甘油酯在含有氯离子的酸性溶液环境中容易转化成3-MCPD，造成检测结果偏高。故本实验选用甲醇钠-甲醇溶液进行碱水解条件的优化。通过比较标准物质（3-MCPD棕榈酸二酯）水解之后生成棕榈酸甲酯的量以考察水解效率。分别比较0.1、0.2、0.5 mol/L甲醇钠-甲醇溶液在水解时间1、2、3、4、5 min棕榈酸甲酯的响应值，选择最佳水解条件，结果见图1。

图1 水解条件对棕榈酸甲酯响应的影响（n=3）Fig. 1 Effect of different hydrolysis conditions on response of methyl palmitate (n = 3)

由图1可知，0.1 mol/L和0.2 mol/L甲醇钠-甲醇水解时，棕榈酸甲酯的峰面积均随水解时间的延长而增加，尤其0.1 mol/L条件下，随着时间的延长增幅明显，在4 min时较1 min响应值提高1 倍。而0.5 mol/L条件下，水解时间2 min时响应值达到高点，之后随着时间延长响应值有所降低。

有研究认为酯交换反应时间应控制在1 min[20]或4 min[24-25]左右，因酯交换反应时间延长会引起氯丙醇的降解。故本研究从上述条件下选出响应值较高的5 个点，即0.1 mol/L条件下水解5 min，0.2 mol/L条件下水解3、4、5 min，0.5 mol/L条件下水解2 min，比较氯丙醇酯含量的高低，结果见图2。

图2结论与图1基本一致：0.1 mol/L水解5 min时含量最高，0.2 mol/L水解5 min和0.5 mol/L水解2 min时含量次之。当配制浓度为0.5 mol/L甲醇钠-甲醇的溶液时，容器底部有沉淀析出，不能形成均匀稳定的溶解液，从而引起实验结果偏差，且碱性较强，对水解时间要求较严，需严格控制在2 min之内。综上考虑，本研究选用甲醇钠浓度为0.1 mol/L，水解时间为5 min，既保证了水解效率最高又适合大批量样品的同时处理。

图2 水解条件对氯丙醇酯测定结果的影响（n=3）=3Fig. 2 Effect of different hydrolysis conditions on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.2 pH值对结果的影响

氯丙醇酯经酯交换反应水解为游离的氯丙醇，过量的甲醇钠形成的强碱体系会使3-MCPD降解，2-MCPD可能有类似反应[20]，需要立即加入中和剂进行中和。本研究比较酯交换反应终止之后，控制pH值为1、2、3、4、5、6条件下氯丙醇酯的含量，结果见图3。3-MCPDE受pH值的影响波动较大，其中，pH 4时3-MCPDE的回收率偏高（116%），2-MCPDE、1,3-DCPE和2,3-DCPE受pH值的影响相对较小。从回收率的稳定性和奶粉中存在缩水甘油酯的可能性，应避开酸性环境，控制pH值为5或6。

图3 pH值对氯丙醇酯测定结果的影响（n=3）Fig. 3 Effect of pH on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.3 水解液萃取过程中萃取溶剂对结果的影响

考虑到配方奶粉所用的配料精炼食用油中可能含有缩水甘油酯[18-19]，故本实验在空白奶粉基质中同时添加已知量的氯丙醇酯和缩水甘油酯标准物质，比较饱和Na2SO4、20% NaCl、饱和NaCl溶液3 种萃取剂对实验结果的影响，见图4。结果发现，20% NaCl和饱和NaCl作为萃取剂的效果一致，均会增加3-MCPDE的含量，增幅为36%。佐证了氯离子存在时缩水甘油酯转化成3-MCPD的结论[23]。为防止缩水甘油酯转化成氯丙醇酯，造成氯丙醇酯的测定值偏高，本研究采用饱和Na2SO4溶液作为萃取剂。

图4 萃取剂对氯丙醇酯测定结果的影响（n=3）Fig. 4 Effect of different extraction solvents on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.4 衍生条件的确定

可供选择的衍生试剂有H F B I、苯基硼酸（p h e n y l b o r o n i c a c i d，P B A）、七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）、三氟乙酸酐（trif l uoroacetic anhydride，TFAA）等。PBA反应可在水溶液中进行，但只能特异性地和二醇类反应，不能衍生1,3-DCP和2,3-DCP[26]；HFBA和TFAA的衍生反应容易进行，但产生的有机酸副产物可能会分解氯丙醇衍生物，且灵敏度不高[26]。相比之下，HFBI衍生后的化合物电负性增强显著，检测灵敏度较高，且化合物比较稳定[27]。缺点是HFBI易与水反应，衍生之前需注意除水，衍生过程中需注意防水。

比较无水硫酸钠和商品化脱水剂（无水硫酸镁-无水乙酸钠（4∶1，m/m））对目标化合物测定结果的影响，发现使用无水硫酸钠对目标化合物的损失较小，且综合考虑试剂成本，最终选用无水硫酸钠作为脱水剂。需要注意的是无水硫酸钠必须经过灼烧处理以消除试剂水分，否则会影响后续衍生。

比较正己烷和异辛烷作为衍生复溶溶剂对氯丙醇酯测定结果的影响，见图5。异辛烷的效果好于正己烷，主要体现在对2-MCPDE和2,3-DCPE的影响上，因此选用异辛烷进行复溶。

图5 衍生复溶溶剂对氯丙醇酯测定结果的影响（n=3）Fig. 5 Effect of derivative solvents on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.5 空白加标回收实验结果

在空白奶粉基质中添加3-MCPD棕榈酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-DCP和2,3-DCP的标准溶液，使含量分别为0.03、0.075 mg/kg和0.15 mg/kg三个水平（以氯丙醇计），按已优化的方法测定，回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）结果见表3。

表3 空白奶粉基质加标回收实验结果（n=6）Table 3 Spiked recoveries of blank milk powder (n =66))

由表3可知，空白奶粉基质在0.03、0.075 mg/kg和0.15 mg/kg水平下的加标回收率在82.2%～113.9%之间，RSD均不大于8.3%。方法的准确度和精密度良好，符合分析的要求。

质量浓度为0.1 mg/L的氯丙醇酯标准品衍生物的总离子流图见图6。加标量为0.15 mg/kg的样品总离子流图见图7。

图6 0.1 mg/L氯丙醇酯标准品衍生物的总离子流图Fig. 6 Total ion current chromatograms of CPFAE derivatives at 0.1 mg/L

图7 加标量为0.15 mg/kg的样品总离子流图Fig. 7 TIC chromatogram of sample spiked at 0.15 mg/kg

2.6 实际样品的测定结果

由表4可见，在所调查的50 份婴幼儿配方奶粉中，3-MCPDE的检出率最高（100.0%），含量也最高，为0.037～0.208 mg/kg，其中0～6、6～12、12～36 月龄的含量分别为0.073～0.208、0.046～0.179、0.037～0.189 mg/kg；其次是2-MCPDE，检出率为42.0%，含量在ND～0.060 mg/kg之间，其中0～6、6～12、12～36 月龄的含量分别为ND～0.060、ND～0.054、ND～0.047 mg/kg；1,3-DCPE和2,3-DCPE均未检出。污染水平与李珊等[17]的研究基本一致。

表4 50 份婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯含量测定结果（ =3）Table 4 Results of determination of CPFAE contents in 50 samples ( = 3)

国内外的婴幼儿配方奶粉，大多是将葵花籽油、玉米油、棕榈油、大豆油等各种精炼植物油复合加入脱脂乳粉中，以从脂肪酸种类方面来模仿母乳。作为含约20%比例脂肪的婴幼儿配方奶粉，其氯丙醇酯的污染主要来源于其精炼植物油配料。不同月龄的配方奶粉氯丙醇酯的含量与其脂肪含量存在一定的相关性。由表4可知，0～6 月龄的脂肪含量大于6～12、12～36 月龄，导致0～6 月龄奶粉中的氯丙醇酯含量最高。

由于目前国内外均未制定氯丙醇酯的安全摄入量，本实验按照德国联邦风险评估机构[28]和欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）[29]的一致做法，假定3-MCPDE和2-MCPDE在人体内可100%转化为3-MCPD和2-MCPD，按3-MCPD的每日耐受摄入量（tolerable daily intake，TDI）进行评估。针对婴幼儿这一特殊敏感群体，氯丙醇酯的暴露风险按EFSA 2016年最新制定的3-MCPD的TDI为0.8 μg/kg进行评估。由表4可知，婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯对不同月龄婴幼儿的平均暴露量分别为：0～6 月龄3.86 μg/kg、6～12 月龄2.00 μg/kg、12～36 月龄1.07 μg/kg。其中，0～6 月龄婴幼儿氯丙醇酯的平均暴露水平最高，是TDI的4.8 倍，100%（15/15）超过限值，P95为4.87 μg/kg。这主要是由于一阶段奶粉脂肪含量较高，而新生儿体质量较低，且奶粉的每日摄入量高；6～12 月龄婴幼儿氯丙醇酯的平均暴露水平是TDI的2.5 倍，94.4%（17/18）超过限值，P95为3.31 μg/kg；12～36 月龄婴幼儿奶粉摄入量少，体质量较大，所以平均暴露水平相对0～6、6～12 月龄较低，是TDI的1.3 倍，但76.5%（13/17）超过限值，P95为1.77 μg/kg。且12～36 月龄婴幼儿对其他富含油脂的食物摄入比重加大，对氯丙醇酯的摄入风险仍不容小觑。本实验是假定目标物在体内的消化吸收率为100%，所以可能存在一定的高估其风险。

3 结 论

对同时测定婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯含量的GC-MS分析方法进行优化，对方法的线性范围、检出限、定量限和准确度等技术参数进行评价，并用此法检测市售50 份婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯的含量。结果显示，3-MCPDE的检出率最高，含量也最高；其次是2-MCPDE；1,3-DCPE和2,3-DCPE均未检出。统计婴幼儿配方奶粉的平均暴露量，0～6 月龄3.86 μg/kg、6～12 月龄2.00 μg/kg、12～36 月龄1.07 μg/kg，分别为TDI的4.8、2.5、1.3 倍。对于将配方奶粉作为主要营养摄入来源的婴幼儿来说，尤其是0～12 月龄的婴儿，氯丙醇酯摄入的健康风险需引起关注。解决氯丙醇酯问题的关键在于植物油配料。为了保护婴幼儿的安全，生产厂家应谨慎选择原料，尽可能降低婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯的污染。