张会亮，黄传峰，李佩璇，江 丰，孙姗姗，丁 宏，曹 进,*

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.临沂市食品药品检验检测中心，山东 临沂 276000；3.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430073）

卡拉胶是红藻的细胞壁多糖，是由半乳糖及半乳糖衍生物构成的半乳聚糖硫酸酯。根据重复结构特征以及1,3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，卡拉胶可分为11种不同构型，主要构型为κ-型、ι-型和λ-型卡拉胶，尤其以κ-型多见[1]。藻体中不存在理想的重复二糖结构的卡拉胶，均为多种卡拉胶结构的混合体，食品级卡拉胶也可看作各种构型卡拉胶的混合物[2]。

“注水肉”是指在生猪、牛、羊屠宰前或屠宰过程中，不法分子以灌胃或向血管泵注等形式，将水掺入动物体内得到的生、鲜肉品。畜肉注水是存在已久的行业乱象，是食品安全聚焦点之一。卡拉胶因具有强大的保水性、增稠性，被不法分子所青睐，用于“注水升级”版本的“注胶肉”，各类媒体已多有报道。注入“卡拉胶水”的肉品，水分黏度增大，不易外流，较“注水肉”更加难以识别。制备“注胶肉”不仅属于欺诈行为，因灌注的胶水中往往掺杂有防腐剂、血、工业色素等物质，改变了肉品组成，引入致病微生物和外来物质污染、重金属超标等风险，还会危害食品安全[3]。

目前“注胶肉”尚无相关检测标准或规范，仅可通过相关水分含量标准判断。相关标准中规定的猪肉的水分质量分数不得高于77%[4]，由于识别的有效性欠缺，对违法样品打击力度不足[5-6]。国外报道了用聚合物基质管状膜传感器作为电极，以电位测定方法定量测定卡拉胶含量[7]。目前国内研究中采用最多的检测“注胶肉”的技术是低场核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术和近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIR）技术。基于样品LF-NMR弛豫特性的判别分析可实现对肉糜注胶程度的分段预测[8]；利用LF-NMR结合主成分分析法，根据肉品中的水分存在状态及分布结果，实现对猪肉中的卡拉胶的检测[9]。NIR方法报道的有结合主成分分析和判别分析法[10]、结合偏最小二乘法[11]建立注胶肉和正常肉的定性判别模型；使用一阶导数对光谱进行预处理，采用因子化法建立定性判别模型[12]等。

上述方法均依赖于判别模型、主成分分析等化学计量学手段，不易推广；判定参数不明确，难以作为定性特别是执法检验的依据，限制了其应用。本实验针对卡拉胶主要来源为人为添加，在新鲜肉品中并不存在的特性，提供了一种利用高效液相色谱-质谱法对卡拉胶特征性降解产物，即标志物进行检测的方法。经多家实验室验证表明，该方法对畜肉中存在的卡拉胶可实现灵敏、特异性识别，可作为打击“注胶”畜肉的有效技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不含卡拉胶畜肉来源于养殖厂，并全程跟踪屠宰过程，其他畜肉样品采购于超市；卡拉胶（食品添加剂级） 石狮市环球琼脂工业有限公司。甲酸铵（批号LH80P38，优级纯） 百灵威公司；盐酸（批号20150930，分析纯） 北京化工厂。实验所用水均为一级水。

1.2 仪器与设备

1290-6460液相色谱-三重四极杆质谱仪、1290-6540液相色谱-飞行时间质谱仪 美国安捷伦公司；vortex-5型涡旋混匀器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；AL 204电子天平 瑞士梅特勒公司；INTEGRAL 3纯水仪美国Milipore公司；ZWY240恒温水浴 上海智城公司；Pro 200高速匀浆机 美国Pro公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品储备液

称取卡拉胶0.1 g，用8 mL 60 ℃温水溶解，转移至10 mL容量瓶中，冷却后用水定容，配制成质量浓度为10 mg/mL的储备液。

1.3.2 样品处理

待测样品用食品料理机充分打碎混匀，称取10 g于50 mL离心管中，加入23 mL水，10 000 r/min匀浆1 min，加入2 mL 12 mol/L盐酸，加盖涡旋30 s后置于80 ℃水浴中20 min，每10 min振摇一次。取出放冷至室温后，4 000 r/min离心5 min，上清液用乙腈1∶1稀释，过0.22 μm尼龙滤膜，供高效液相色谱-质谱检测。

1.3.3 标准工作液的制备

称取打碎混匀的不含卡拉胶的畜肉10 g于50 mL离心管中，分别加入卡拉胶对照品储备液0.1、0.2、0.3、0.4 mL，加入水使液体量为23 mL，10 000 r/min匀浆1 min，以下操作同1.3.2节，供高效液相色谱-质谱检测。

1.3.4 仪器条件

1.3.4.1 液相色谱条件

色谱柱：W a t e r s B E H A m i d e色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A为10 mmol/L甲酸铵溶液，B为乙腈；流速：300 μL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。梯度洗脱，流动相B相比例为：初始80%，3 min内变至40%，保持至5 min结束。

1.3.4.2 串联三重四极杆质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式扫描；毛细管电压4 000 V；检测方式：多反应监测；干燥气温度200 ℃，流量5 L/min；鞘气温度280 ℃，鞘气流量8 L/min；雾化气压力30 psi。监测离子对信息见表1。1.3.5 高分辨质谱条件

表1 串联三重四极杆质谱中的卡拉胶特征离子对Table 1 Triple quadrupole mass spectrometric parameters for carrageenan

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式扫描；干燥气温度325 ℃；流量10 L/min；雾化气压力40 psi；碎裂电压：135 V；毛细管电压4 000 V；检测方式：一级质谱扫描，用于定性的离子信息见表2。

表2 高分辨质谱中的卡拉胶特征离子Table 2 Characteristic ions of carrageenan by high resolution mass spectrometry

1.3.6 定性和定量方法

表1中两对离子均可用于定性和定量。样品溶液中多反应监测色谱峰的保留时间、丰度比与标准工作液色谱峰一致时，可判定检出卡拉胶成分。使用高分辨质谱确认时，出现2 种或2 种以上表2中离子时，可确证检出。

定量测定以标准工作溶液中含卡拉胶的质量为横坐标，以表1中定量离子的色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。按外标法计算待测样品中卡拉胶的含量。

2 结果与分析

2.1 标志物离子的确定方法

卡拉胶的降解方式有酶法、酸法和物理方法[13-16]。不同降解方式可得到不同系列的卡拉胶寡糖[16-18]。使用酸法降解得到的m/z500左右的低分子质量端寡糖的种类多于酶法和物理方法[18]，因此本实验优先使用酸法降解。

图1 卡拉胶标志物的确定过程Fig. 1 Flow chart for determination of carrageenan markers

实验条件下对卡拉胶溶液降解，使用1.3.5节中的条件进行高分辨一级质谱采集，得到一系列与文献报道一致的产物离子[2,13-19]。为了从中筛选可用的标志物，取阴性畜肉3 份作为本底组，卡拉胶溶液3 份作为对照组，进行了平行处理，采集高分辨一级质谱。数据经过分子特征提取，使用Mass Profiler Professional软件进行差异组分查找，确定可能的标志物。增加血液、脏器作为本底进一步验证，排除本底中存在的离子，最终得到了表2中的特异性标志物，流程见图1所示。

图2展示了Mass Profiler Professional软件描绘的本底组和对照组中化合物分布示意图。图中每条折线均代表一种化合物，纵坐标代表化合物含量水平，横坐标代表样品标签：标签2、3、4为卡拉胶溶液样品，标签7、8、9为阴性畜肉样品。卡拉胶标志物的含量应满足在2、3、4中较高，在7、8、9中较低，如图2椭圆圈示的折线。

图2 差异组分分析结果Fig. 2 Re sults of differential component analysis

在串联四极杆质谱方法中，最终使用丰度较大的单电荷离子：κ-卡拉胶基本结构单元[G4S-A]和ι-卡拉胶基本结构单元[G4S-A2S]作为特征离子，见图3。

图3 用于检测的卡拉胶标志物离子信息Fig. 3 Information about carrageenan ions used as markers

2.2 前处理条件的优化

卡拉胶溶液在0.1 mol/L稀酸存在的条件下即可发生降解生成寡糖[20]。但卡拉胶与蛋白质共存时可形成牢固的交联体系，使用卡拉胶酶或稀酸降解体系中的卡拉胶很难得到降解产物[21-22]；在强酸和高温条件下，体系中的蛋白质先被破坏，随后发生卡拉胶的降解[23]。此外，酶法降解卡拉胶对试剂和成本要求都较高，而使用超声物理降解法所需时间过长，酸法降解是最简便的方法。

考察体系中不同浓度盐酸对降解效率的影响，见图4。对于卡拉胶的水溶液，体系中盐酸浓度为0.1 mol/L时，80 ℃水浴20 min即可得到标志物离子；但当卡拉胶与肉共存时，体系中0.1 mol/L盐酸不能使卡拉胶降解；0.5 mol/L盐酸仅可得到少量降解产物；当体系中酸浓度增大至1 mol/L时，可以获得降解产物，当酸浓度增至2 mol/L时，降解产物浓度没有明显提高，最终选择体系中存在1 mol/L盐酸进行降解，见图4。

图4 盐酸浓度对降解效率的影响Fig. 4 Effect of HCl concentration on degradation efficiency

卡拉胶的热降解遵循伪一级动力学，延长反应时间有助于得到更多产物[24]，但本实验使用的降解条件较强，延长降解时间对降解产物丰度改善不明显，见图5。最终，本实验使用1 mol/L浓度盐酸和80 ℃条件下20 min完成了卡拉胶的降解。

图5 反应时间对降解效率的影响Fig. 5 Effect of reaction time on degradation efficiency

2.3 色谱-质谱条件与峰形

降解得到的卡拉胶寡糖标志物具有较强极性，在C18色谱柱上保留较弱。一些卡拉胶寡糖的表征研究中使用庚胺等离子对试剂-反相色谱[25-26]或凝胶排阻色谱[15,27]，以达到多种寡糖之间的分离，在此基础上研究降解产物分布，并进行以一级质谱为主的定性分析[15,19,28]。本实验目的不在于分离不同寡糖，因此未引入庚胺等离子对试剂，而是使用亲水保留色谱达到分离。

在[A]、[G4S]、[A2S]等六元环中，m/z 403为母离子的多反应监测峰形较m/z 483差，这可能是因为[A]环的空间位阻小、六元环构象差异导致[10,29]。实验考察水-乙腈和10 mol/L甲酸铵溶液-乙腈体系对分离效果的影响。含甲酸铵的流动相体系中，目标化合物峰形得到一定程度改善。由于使用反-反相分离模式，进样前用乙腈对处理得到的溶液进行稀释，以减少溶剂效应。

2.4 方法学考察

分别使用牛肉、羊肉、猪肉3类畜肉，描绘基质加标工作曲线，并在0.1、0.2 g/kg和0.4 g/kg三水平分别进行加标，其中0.2 g/kg水平重复测定6 次。计算回收率和方法重复性精密度。串联四极杆质谱中的代表性图谱见图6。

图6 使用串联四极杆质谱采集得到的色谱图Fig. 6 Representative chromatograms from triple quadrupole mass spectrometry

本实验在0.1～0.4 g/kg的含量范围内考察方法学指标。原因如下：用于“注胶”的卡拉胶溶液适宜的质量分数在0.2%～1%之间，质量分数高于1%，溶液易凝固成胶状而无法进行灌注；质量分数低于0.2%，溶液注入后被体液进一步稀释，起不到保水作用。问题畜肉注入水的质量分数一般大于5%。0.1 g/kg含量的卡拉胶相当于向牲畜体内注入了活体质量分数5%的0.2%卡拉胶溶液，属于较低含量水平，以0.1 g/kg作为标曲最低点，可满足实际应用中对灵敏度的要求。

表3 串联三重四极杆质谱法的方法学指标Table 3 Methodological parameters of triple quadrupole mass spectrometry

从表3可见，猪、牛、羊肉3 种基质各3 个添加水平的加标回收率在90%～120%之间。添加量为0.2 g/kg重复6 份平行测定的相对标准偏差均小于5%。两对离子对的主要差异在于灵敏度和线性系数。m/z403＞241离子对的线性相关系数在0.99以上；m/z483＞403离子对的线性系数较差，仅能达到0.95以上。从曲线斜率上看，m/z403＞241离子对的灵敏度要优于m/z483＞403离子对。两对离子的灵敏度和线性差异的原因是其来源不同：产生m/z403母离子的是κ型基本单元[G4S-A]，其在卡拉胶聚合链中占比较高；产生m/z483母离子的是ι-卡拉胶基本结构单元[G4S-A2S]，其在卡拉胶聚合链中占比较低。同时，降解过程中，ι-卡拉胶硫酸基团容易脱去[27,30]，也导致m/z483离子强度降低，影响线性。

2.5 实际样品分析结果

对采购于不同正规超市的猪、牛、羊肉样品各10 份进行检测，未检出阳性结果。同时采购了标签标识添加卡拉胶的调理牛排（生肉）5 批次，均检出卡拉胶，含量为0.086～0.39 g/kg。此外，检测一批标识含卡拉胶的猪肉火腿肠（熟肉），检出含量为0.087 g/kg。实际检测的标识含卡拉胶样品，结果未出现假阴性。

3 结 论

本实验建立生、鲜畜肉中卡拉胶测定的液相色谱-串联三重四极杆质谱和液相色谱-串联高分辨质谱法，可实现掺入卡拉胶的“注胶肉”的定性和定量测定。该法前处理过程简单，检测指标明确，方法线性范围、准确度、精密度及检出限均满足相关标准的要求，可作为打击“注胶肉”乱象的有效手段。