赵 凤，许 萍，曾诗雨，杨 兴,*

（1.贵州省农业科学院水产研究所，贵州 贵阳 550025；2.通标标准技术服务（上海）有限公司农产食品部，上海 200030）

发酵酸鱼是贵州侗族的传统美食之一，其腌制方式独特，味道香美[1]，深受当地居民的喜爱，也是招待客人的美味佳肴，具有丰富的饮食文化内涵[2]。其制作方式简单，只需将鱼肉放在干净的容器内鱼与糯米粉交替平铺，然后在适宜的温度下进行密封发酵。鲟鱼是贵州山区的特色冷水鱼，目前主要以鲜活销售为主，为填补鲟鱼加工市场的空白，需开发一种发酵鲟鱼产品。

挥发性风味物质种类较多，包括酸类、醇类、醛类、酯类、酮类、芳香烃、酚类等，其中酸、醇、酯、酮、醛具有较低的阈值，对风味的形成具有重要作用，因此检测食品中的挥发性风味物质非常重要，尤其是对发酵产品等气味显著的食品。

固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）的主要特点是样品需求量少、溶剂消耗少、灵敏度高、重复性和线性好，而且还可以将采样、萃取、浓缩、进样集为一体，操作简单快捷，结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用可以萃取和分析鉴定很多种挥发性风味物质[3]。目前水产品中挥发性风味物质的主要研究方法是SPME-GC-MS技术[4-8]，主要方法是利用SPME萃取样品中的挥发性物质，然后GC-MS进行分离和鉴定。近年来一些学者对各种腌鱼的风味进行研究[9-11]，但是关于发酵鱼肉的风味研究很少，如李春萍[12]研究臭鳜鱼发酵过程中的风味物质，发现醇类含量最高，而丁酸、三甲胺和芳樟醇对风味贡献较大，管娟[13]研究固态发酵鳓鱼，发现接种清酒乳杆菌发酵时挥发性羰基类以及醇类、酸类化合物的种类和含量明显增加。本实验以鲟鱼为原料，采用传统的发酵工艺，利用SPME-GC-MS方法分析从原料到发酵成熟过程中鲟鱼肉中的挥发性风味物质种类和含量的变化，探讨发酵鲟鱼风味形成的过程，旨在研究整个发酵过程鲟鱼的风味品质，以期为鲟鱼的综合加工利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲟鱼由惠众渔业有限公司惠水养殖基地提供。

氢氧化钠、氯化钠、磷酸盐（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；亚油酸标准品 德国CNW科技公司。

1.2 仪器与设备

SPME装置：手动进样手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取头 美国Supelco公司；GC6890-MS5975 GC-MS仪、HP-5MS弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

工艺流程：新鲜鲟鱼→取肉→腌制→发酵→成品。

操作要点：取鲜活的鲟鱼宰杀，去头、尾、内脏，取肉沥干，鱼片切成每块质量20～30 g，添加鱼块质量3%食盐和各种香辛料（辣椒、花椒、姜等），搅拌均匀，在4 ℃腌制2 d，然后在50～60 ℃干燥3 h，干燥至水分质量分数约55%～60%，冷却至室温，在容器的底部铺上部分糯米粉，然后鱼与糯米粉交替平铺，压紧，顶部铺上一层糯米粉后夯实，加盖，封严，20～24 ℃发酵5～6 周，直至pH 4.1～4.4制得即食休闲风味发酵鱼制品。

样品采集：选择新鲜、腌制、发酵5、10、20、25、35 d的鲟鱼发酵样品（编号分别为CX、CTA、CTB、TCC、CTD、CTE、CTF），每个时期取3 个平行作为重复，其中发酵阶段取3 个不同位置作为3 个样品。

1.3.2 SPME-GC-MS检测

研究报道萃取时添加饱和NaCl溶液可以有效终止鱼肉酶活性，降低挥发性风味成分的溶解度，促进挥发性化合物的挥发，从而提高萃取效率[14]。将各组样品分别与0.18 g/mL的NaCl溶液按1∶1质量比混合，匀浆后称取5 g样品到顶空瓶中待测，平行测定3 次。

SPME条件：65 μm萃取头250 ℃老化30 min后，插入样品瓶中，距顶端4 mm左右，在35、45、60、80、95 ℃水浴温度吸附40 min，然后插入GC进样口中，250 ℃解吸5 min后，取出萃取头，GC-MS分析检测。

GC条件：HP-5MS弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式进样；升温程序：柱初温40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至160 ℃，而后以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃；载气（He）流量1.0 mL/min。

MS条件：传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 35～450。

1.3.3 定性与定量分析

定性：利用系统自带NIST 02和Wiley质谱数据库分析，且仅当正反匹配度均大于800（最大值1 000）的化合物才予以报道[15-16]。具体以C7～C40的正构烷烃为标准品，通过和文献中的保留指数比对计算标准品的保留指数，再结合数据库的分析，最终对化合物进行定性。

定量：利用面积归一化法计算各成分在样品中挥发性成分的相对含量，峰面积积分由安捷伦工作站完成；每个样品3 个重复，结果作方差分析，利用SPSS 21.0软件分析处理[17]。

1.3.4 关键风味化合物的确定

采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法[18]，选择样品中总体风味贡献最大的组分定义ROAVstan=100，其他挥发性物质ROAV则按下式计算：

式中：Cri为挥发性物质的相对含量/%；Ti为相应物质感觉阈值/（μg/L）；Crstan为对总体风味贡献最大组分的相对含量/%；Tstan为对应物质的感觉阈值/（μg/L）。

1.4 数据处理

利用Xcalibur软件分析GC-MS数据；所有实验数据通过Excel、SPSS 17.0分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段鲟鱼中挥发性成分分析

采用SPME-GC-MS对各发酵阶段鲟鱼样品的挥发性成分进行测定，得到不同发酵阶段样品的GC-MS总离子流图，见图1。将取得的色谱峰在NIST谱库检索以及参考文献，确定鲟鱼发酵过程中共鉴定出108 种挥发性风味物质，其中烃类、酯类、芳香类、酮类、醛类、酸类、酚类、醇类以及其他类分别为17、13、6、11、21、7、1、29 种和3 种。

图1 不同发酵阶段鲟鱼挥发性成分总离子流图Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile compounds in fermented sturgeon meat sampled at different fermentation stages

由表1可得，不同发酵阶段鲟鱼肉的挥发性风味成分的种类以及相对含量的变化比较明显。鲜鱼、腌制、发酵5、10、20、25 d和35 d 7个阶段的挥发性风味成分的种类分别为38、48、66、72、75、76 种和84 种；随着发酵时间的延长，挥发性风味物质的种类由前期的38 种增至成熟时的84 种，酯类、酸类和酚类的相对含量增加最为明显，由前期的未检出到发酵成熟时相对含量已达到19.63%。发酵成熟时，醛类、醇类、烃类及酮类是发酵鲟鱼的主要挥发性成分，说明发酵过程中这些物质的变化反应鲟鱼发酵风味的形成过程。

2.2 鲟鱼发酵过程中挥发性风味物质变化分析

2.2.1 醇类化合物

在鲟鱼发酵过程中醇类化合物的种类由新鲜时的12 种增加至发酵成熟时的26 种，但是醇类化合物的相对含量逐渐降低。在新鲜鱼肉中的主要醇类物质是2-辛炔醇和1-辛烯-3-醇，但在腌制后相对含量明显下降且随发酵时间的延长相对含量越来越低；腌制后的主要醇类物质是1-戊烯-3-醇和桉油醇，其中相对含量也是随发酵时间的延长逐渐降低，但是桉油醇在新鲜鱼肉中未 检测出。己醇在发酵初期的相对含量最高，随后逐渐降低，到发酵成熟时相对含量比在新鲜和腌制2个阶段的相对含量都高。相对含量较高的桉油醇和芳樟醇仅发酵鲟鱼中产生，主要原因是这2种物质不是水产品本身所含物质，而是添加香辛料进入鱼体的，成为加工类鱼制品的新风味成分[12]。同样雪松醇和松油醇也有可能是通过添加剂进入鱼体，成为发酵鲟鱼的特有风味物质。2-丁醇仅在发酵成熟后检测出。其中饱和醇类的阈值高，所以对风味的贡献就小[19]。不饱和醇阈值低，有特殊的香气[20]，对鱼类风味的贡献大。1-辛烯-3-醇在水产品中非常常见，本实验中此物质在新鲜鱼肉中的相对含量最大，但随着发酵时间延长，相对含量明显下降，它是亚油酸的氢过氧化物降解产物[21]，可产生蘑菇风味[22]，普遍存在于淡水鱼及海水鱼的挥发性物质中[23]，因其阈值低，故对鲟鱼的风味形成贡献很大。

2.2.2 烃类化合物

在鲟鱼发酵过程中检出的烃类化合物共17 种，各个阶段均检测到大量烃类化合物，相对含量较高，但饱和烃化合物阈值一般都很高，所以对鲟鱼发酵产品的风味贡献较小。2,6,10,14-四甲基十五烷能够赋予食品清香和甜香[24]。十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十七烷可能是由高分子质量的非不饱和脂肪酸降解产生，发酵过程中相对含量逐渐降低可能是被进一步分解为小分子化合物。研究发现，C6～C19存在于鱼类和甲壳动物类的挥发性风味物质中，但因其阈值高，对水产品的整体风味贡献不大[25]。在整个发酵过程中检测到多种萜烯类化合物，其在其他水产研究中也有相关报道[26-28]检测到。在一定条件下，烃类化合物可形成醛、酮和醇类等风味物质[29]，所以对鲟鱼风味的形成具有潜在作用。

2.2.3 酯类化合物

酸和醇可发生酯化反应形成酯类化合物[30]。在整个鲟鱼发酵过程中，新鲜鲟鱼和腌制阶段未检测到酯类物质，发酵成熟后累积了大量的酯类物质，酯类物质可赋予食品水果香味[31-32]，是促进鲟鱼发酵风味形成的重要物质。在发酵成熟时，乙酸乙酯相对含量在酯类物质中最高，又因其阈值低，故对鲟鱼发酵样品的风味贡献率较大，使得发酵鲟鱼具有特殊的酯香味。

2.2.4 醛类化合物

醛类化合物主要是酶和微生物氧化脂类化合物形成的[33]，阈值低，因气味加和作用，即使微量也会对产品的风味产生很大影响[34]，因此被认为是腌腊鱼的主要特征风味物质。鲟鱼发酵过程中共检测到21 种醛类物质，随着发酵时间的延长醛类化合物的种类增多。己醛浓度高时产生酸败味，浓度低时则产生清香味和香草味[35]，是亚油酸的氧化产物[36]，在鲟鱼发酵过程中其相对含量随着发酵时间的延长逐渐降低，使得发酵成熟产品产生更好的香味。壬醛有柑橘的香味[37]，阈值低，在发酵过程中均检测到壬醛的存在，是发酵鲟鱼的关键性风味物质。2,4-庚二烯醛是鱼类的腥味物质[11]，是生鱼肉的特征挥发物质，随着发酵的延长其相对含量逐渐降低，使得发酵鲟鱼的腥味减弱。2,4-癸二烯醛具有油炸的脂香味，在新鲜和腌制过的鲟鱼中被检出[38]。苯甲醛有甜橙气息[39]，在发酵过程中检测到这种物质，因其阈值低，所以对风味的贡献大。十二醛、十三醛、十四醛、十六醛、7-十六烯、9,17-十八碳二烯醛这些分子质量大的物质只在腌制和发酵的样品中被检出，在新鲜鱼肉中未检测到，说明这些物质对发酵鲟鱼的特征风味有重要贡献。

2.2.5 酮类化合物

酮类化合物具有特殊的香味，大多数呈现脂肪味和焦燃味，因其阈值高于其同分异构体的醛[40]，所以对鱼肉风味的贡献比醛类小。酮类化合物可增强鱼肉的腥味，本实验中新鲜和腌制的鲟鱼酮类化合物在挥发性物质中的相对含量比发酵各个阶段的相对含量都高，这就可解释发酵成熟的鲟鱼腥味很弱的原因。3,5-辛二烯-2-酮具有动物油脂味，普遍存在新鲜的鱼中，所以在发酵样品中未检出。

2.2.6 酸类化合物

整个发酵过程中共检测到7 种酸类物质。这些物质在新鲜和腌制后的鱼肉中都未检测到，只是在发酵过程中或者发酵结束才检测到。有研究表明[41]，酸类物质一是由细菌利用氨基酸发酵形成，二是脂质氧化形成。所以本实验中酸类的形成是在微生物的作用下发酵形成还是鱼肉中脂质物质氧化形成还不确定，待进一步研究。

表1 不同发酵阶段鲟鱼挥发性风味物质成分的相对含量Table 1 Relative contents of volatile fl avor compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times%

续表1%

续表1%

2.3 不同发酵阶段鲟鱼ROAV

表2 不同发酵阶段鲟鱼挥发性风味成分的ROAVTable 2 ROAVs of volatile compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times

ROAV越大说明这种物质对样品的总体风味贡献也越大。一般认为ROAV不小于1的物质为样品的关键风味化合物，ROAV大于等于0.1且小于1的组分对样品的总体风味具有重要影响[42]。如表2所示，1-辛烯-3-醇、壬醛和癸醛是新鲜鲟鱼和整个鲟鱼发酵过程中的关键风味物质。苯乙醛和柠檬烯是发酵开始至成熟的关键风味化合物。新鲜鲟鱼肉的主体风味物质为2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、癸醛、己醛等；腌制后的鲟鱼肉主体风味物质为壬醛、1-辛烯-3-醇、己醛、癸醛、柠檬烯等；发酵5 d鲟鱼肉的主体风味物质为1-辛烯-3-醇、柠檬烯、壬醛、乙酸乙酯、庚醇等；发酵10 d鲟鱼肉的主体风味物质为壬醛、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、柠檬烯、癸醛等；发酵20 d鲟鱼肉的主体风味物质为壬醛、柠檬烯、1-辛烯-3-醇、癸醛、乙酸乙酯等；发酵25 d鲟鱼肉的主体风味物质为壬醛、柠檬烯、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、癸醛等；发酵35 d鲟鱼肉的主体风味物质为乙酸乙酯、柠檬烯、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醇等。可以看出前期和后期的关键风味大致相同，与中期的关键性风味物质略有不同，其具体原因有待进一步研究。但蔡瑞康等[43]在研究大黄鱼糟制过程中风味物质发现糟制前期关键风味物质是壬醛、辛醛和2,3-戊二酮；中期是乙酸乙酯、辛酸乙酯和苯甲醛；成熟时为乙酸乙酯和辛酸乙酯。这可能与发酵时选择鱼的种类有关。

3 结 论

采用SPME-GC-MS技术可更全面、准确地鉴定鲟鱼整个发酵时期的挥发性风味物质，然后采用ROAV法分析发酵过程中各样品的主体风味构成。结果表明主要关键风味物质由2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和壬醛、己醛、乙酸乙酯组成。且前期和后期的关键风味大致相同，与中期的关键性风味物质略有不同。通过研究鲟鱼发酵过程中风味物质种类和相对含量变化，可为风味的形成机理及品质控制提供参考依据，为提高鲟鱼发酵的风味品质提供方向。